中国公共卫生  2011, Vol. 27 Issue (3): 299-301   PDF    
引用本文
刘忠, 李文华. 高原低氧环境下大鼠RAAS水平及ACE2表达变化[J]. 中国公共卫生, 2011, 27(3): 299-301.
LIU Zhong, LI Wen-hua. Changes of RAAS and right ventricular ACE2 activity in adult SD rats exposed to high altitude hypoxia[J]. Chinese Journal of Public Health, 2011, 27(3): 299-301.
高原低氧环境下大鼠RAAS水平及ACE2表达变化
刘忠1, 李文华2     
1. 西藏大学医学院基础部病理生理教研室 西藏 拉萨 850000;
2. 西藏民族学院医学院
收稿日期: 2010-06-23.
基金项目: 西藏科技厅科研基金[JG(2006)5]
作者简介: 刘忠(1962- ),男,山东单县人,副教授,硕士,研究方向:高原病理生理学。
通讯作者: 李文华,E-mail:xzmylwh@163.com
摘要: 目的 探讨大鼠血浆肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)在高原低氧习服过程中的作用及其右心室血管紧张素转换酶2(ACE2)表达变化。方法 将40只雄性SD大鼠随机分为4组,分别为缺氧1、3、30d组,对照组(西安地区海拔5 m);3个缺氧组动物由西安耗时1 d带到青海格尔木(海拔2 700 m)、3 d带到西藏那曲(海拔4 500 m)及那曲饲养30 d,用放射免疫法测定大鼠血浆肾素(PRA),血管紧张素Ⅱ(ATⅡ),醛固酮(ALD)的浓度,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),免疫印迹、(western blot)检测各组大鼠心脏右心室心肌ACE2mRNA、蛋白水平的表达变化。结果 缺氧1d组血浆PRA含量为每小时(5.15±0.86)ng/mL,ATⅡ、ALD含量分别为(92.10±10.25)、(85.60±29.40)pg/mL;缺氧3、30 d组血浆PRA含量分别为每小时(7.12±0.31)和(5.37±0.28)ng/mL,ATⅡ、ALD含量分别为(160.53±10.84)、(127.45±30.6)和(56.30±25.23)、(82.54±26.78)pg/mL;缺氧30 d组右心室明显肥大伴右心功能明显上调,同时右心室ACE2 mRNA、蛋白合成均有明显增加(P<0.01)。结论 高原缺氧大鼠RAAS在高原习服中参与并发挥重要作用,慢性高原低氧环境下大鼠心肌组织ACE2 mRNA、蛋白水平显著上调。
关键词: 高原低氧     血浆肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)     血管紧张素转换酶2(ACE2)表达    
Changes of RAAS and right ventricular ACE2 activity in adult SD rats exposed to high altitude hypoxia
LIU Zhong1, LI Wen-hua2     
Department of Pathophysiology, Division of Basic Medicine, Medical College of Tibet University, Lhasa 850002, China
Abstract: Objective To study the function of the rennin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) under high altitude hypoxia and to investigate effects of high altitude hypoxia on the angiotensin conversion enzyme 2 (ACE2) mRNA and protein expressions in right ventricle in SD rats.Methods Forty male adult Sprague-Dawley (SD) rats were divided randomly into 4 groups: group A with one day hypoxia (moved from 5 to 2 700 m above sea level in one day), group B with three days hypoxia(moved from 5 m to 4 500 m above sea level in three days), grou C with 30 day's hypoxia(raised at 4 500 m above sea level for 30 days), and group D-the control(raised at the palce of 5 m above sea level).The plasma rennin activity(PRA), serum angiotensin(AT), and serum aldoxterone(ALD) of the rats were detected with radio immunoa ssay.ACE 2 mRNA and protein in the tissue of right ventricle were measured by reverse transcriptase (RT) PCR and western blot.Results The contents of PRA, AT, and ALD were 5.15±0.86 ng/mL·h, 92.10±10.25 pg/mL, and 85.60±29.40 pg/mL for group A, 7.12±0.31 ng/mL·h, 160.53±10.84 pg/mL, and 56.30±25.23 pg/mL for group B, and 5.37±0/28 ng/mL·h, 127.45±30.6 pg/mL, and 82.54±26.78 gp/Ml for group C, respectively.The hypertrophy of right ventricle was observed and ACE 2 mRNA and prote in synthesis were inc reased in group C compared with those of the control group(P<0.01).Conclusion RAAS is correlated with the acclmiatization of high a ltitude hypoxia environment and has important effect.ACE2 mRNA and prote in synthesis are increased under high altitude hypoxia environment, suggesting that ACE2 may play a role in high altitude hypoxic adaptation of the heart.
Key words: high altitude hypoxia     RAAS     ACE2 expression    

生物对高原环境有生理性适应水平和生物性适应水平。 机体针对低氧环境在几天或几周中建立起一系列代偿机制,以适应低氧环境,称生理性适应,也称习服( acclim a tiza tion) 〔1〕 。血浆肾素- 血管紧张素- 醛固酮系统( RAAS) 是调节神经体液和心血管功能的主要系统,对维持人体血压和水电解质平衡起重要作用 〔2〕 。既往认为,血管紧张素转换酶 ( ACE) 是唯一调节RAAS 主要的效应分子血管紧张素 ( AngⅡ)的关键酶,但目前认为ACE2 的主要作用是与ACE 共同调节体内Ang 1~ 7、Ang 、Ang 的水平,对体内血压、 体液和内环境稳定起重要的调控作用 〔3〕 ,RAA S在缺氧环境下对心脏结构重塑和功能改变起重要作用 〔1〕 。本研究对不同海拔地区大鼠RAAS 在高原低氧习服中的作用进行探讨现将结果报告如下。

1 对象与方法 1.1 实验动物

40只体重200~ 243 g 的清洁健康级雄性 SD大鼠(西安交通大学动物中心)。全部大鼠饲养条件一致,自由摄食,喂以大鼠标准饲料,饮用蒸馏水。

1.2 仪器与试剂

Tr ipure Iso lation Reagent(瑞士Roche公司),M -MLV反转录酶(日本TOYOBO公司),引物合成及Taq DNA 聚合酶(上海生工公司),羊抗大鼠ACE2 多克隆抗体IgG(美国 Santa Cruz公司),辣根过氧化酶标记兔抗山羊IgG(北京中杉公司),蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(瑞士Roche公司)。

1.3 动物分组及处理

随机分为4组,分别为缺氧1、3、30 d 组,对照组(西安地区,海拔5 m )。缺氧组动物由西安用汽车耗时1 d带到青海格尔木(海拔2 700 m ) 、3 d带到西藏那曲 (海拔4 500 m )及于那曲饲养30 d。

1.4 RAAS指标检测

采用腹腔麻醉注射方法于不同时间点处死动物。下腔静脉取血2 mL,离心分离血浆,冻存封管存放入液氮保存备用。采用放射免疫法测定大鼠血浆肾素 ( PRA),血管紧张素( AT ) ,醛固酮( ALD)的浓度,开胸摘取心脏,然后将右心室心肌组织迅速放入液氮中保存。

1.5 ACE2 mRNA 表达检测

取液氮保存心肌样本,Tr ipu re 试剂盒提取组织总RNA,利用M MLV 反转录酶反转录合成 cDNA,然后以cDNA 产物为模板分别进行目的片断PCR 扩增。引物序列及扩增条件如下: ACE2,5'- GGAGGAGAATGC CCAAAAGATGTCGTCCAATC2CTGGTTCAAGTA 3' ,GenBank 序列NM _001012006,59℃ ,共35 个循环; 甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶( GAPDH ),5’- TGGAAAGCTGTGGCGTGATGTCCACCAC CCTGTTGCTGTAGC 3’ ,GenBank 序列M17701,58℃ ,共26 个循环。扩增产物经5%琼脂糖凝胶电泳后成像,用凝胶成像系统进行图像分析,以吸光度A ( ACE2) /A ( GAPDH ) 表示 ACE2 mRNA 表达量的变化。

1.6 免疫印迹(W esternblot)检测ACE2 蛋白表达

取液氮保存的心肌样本,加入含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒片的蛋白提取缓冲液( pH = 7 4),剪碎、重悬,13 000 r /m in 高速匀浆,4℃ ,1 000 g离心30 m in,收获上清- 70℃ 保存 〔4〕 。考马斯亮蓝G250进行蛋白定量,取200 μ g 蛋白进行常规SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS PAGE ) 。B io - Rad 半干转印仪 2 mA / cm2 转印60~ 90 m in 至硝酸纤维素薄膜( PVDF )上。 TBST(脱脂奶粉1 0 g溶于20 mL的0 01m o l/L PBS中)配制的5%脱脂奶粉室温封闭1 h; 加1:500封闭液稀释的一抗 ( 羊抗大鼠ACE2 多克隆抗体) 室温孵育过夜; 加TBST 1:2 000稀释的辣根过氧化酶标记马抗羊二抗,室温孵育2h; 显色5m in。凝胶成像系统分析处理,蛋白含量以平均吸光度 ( A )值× 面积( Int mm2 )表示。

1.7 统计分析

应用SPSS15.0软件进行统计学处理,组间比较采用单因素方差分析,计数资料比较用 χ2 检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 不同组别大鼠RAAS系统指标变化(表 1)
表 1 不同缺氧时间大鼠血浆PRA、ATⅡ ALD 含量( x± s , n= 10)

结果显示,随着缺氧时间延长,血浆PRA,AT 的含量呈上升态势,ALD 含量逐渐下降(P < 0 .05)。

2.2 低氧对大鼠心脏右心室ACE2 mRNA 表达影响(图 1)
注: M: 标准; 1: 对照组; 2: 缺氧1 d; 3: 缺氧3 d; 4: 缺氧30 d。 图 1 右心室心肌组织ACE2 mRNA电泳图

对照组、缺氧1、3、30 d组ACE2 mRNA 表达分别为( 0.28± 0.29)、( 0.34± 0 .27)、( 1 . 00 ± 0.48) 和( 2.03± 0.5) 。缺氧30 d 组右心室ACE2 mRNA 表达明显高于对照组及缺氧 1、3 d组( P< 0 . 01)。

2.3 低氧对心脏右心室ACE2 蛋白水平表达影响( 图 2)
注: 1: 对照组; 2: 缺氧1 d; 3: 缺氧3 d; 4: 缺氧30 d。 图 2 W estern blo t检测右心室心肌组织ACE2 蛋白表达

对照组、缺氧1、3、30d组心脏右心室ACE2 蛋白水平表达分别为( 0.05± 0 .00)、( 0. 03± 0.01)、( 0.06 ± 0 .02) ,( 0. 10 ± 0. 03)。缺氧30 d组右心室ACE2蛋白水平明显高于对照组及缺氧1、3 d组( P < 0 01)。

3 讨论

从平原进入高原,生物对高原环境的适应机制比较复杂,机体从整体、器官、细胞及分子水平等不同层次适应高原环境 〔5〕 。将大鼠从平原引入高原,血浆PRA,AT 含量上升,ALD含量下降,促使血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ ( AT ),ATⅠ 在肺中转化为ATⅡ ,循环中的ATⅡ 广泛影响全身小动脉的紧张度,以内脏、皮肤的血管收缩最为明显,外周阻力升高,迫使部分血液流向心、肺等重要脏器,保证了重要脏器的血液供应 〔1〕 。急进高原地区后ALD含量下降,ANP浓度升高 〔6, 7, 8〕 ,发挥其排钠利水的作用,同时又钝化ALD对AT 的反应性,以此缓解缺氧造成的急性容量负荷增加 〔6〕 。

高原心脏适应性变化以右心室为主的心肌细胞肥大、纤维化伴心功能上调为主要特点,RAAS 在其形成过程中起重要作用 〔1, 9〕 。多数研究认为心肌缺血、缺氧以及负荷过重导致的损伤可以上调心肌局部ACE2表达 〔9, 10, 11, 12〕 ; 缺氧可以上调 H epG2细胞ACE2表达 〔13〕 ; 与本实验结果一致。作为组织中 RAAS系统的限速酶之一,ACE2 在转录水平受到底物以及产物的广泛调节,体内AngⅡ 、Ang Ⅰ、ACE 水平的变化均对其有显著的影响; 如AngⅡ 通过AT1受体对心、肾、星形胶质细胞 ACE2 mRNA水平起负向调控作用,而这种影响均可以被 ACE抑制剂以及Ang1 ~ 7抑制 〔14〕 。高原缺氧环境下可以促使循环AngⅡ 、AngⅠ 、ACE、肾素,右心室心肌AngⅡ 、ACE 的活性上调,可能与ACE2表达水平的变化有关。ACE2与高原缺氧心脏适应性变化有关,可能起到避免过度心肌结构重塑、保障正常循环功能的作用。

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