人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的gag、pol和env是编码HIV-1结构蛋白、蛋白酶、逆转录酶、整合酶和外膜蛋白的结构基因。现有的HIV-1感染诊断方法主要是针对这3个基因或它们编码的产物。1988年,Ou教授^〔1〕报道了针对gag、env基因的PCR诊断方法,随后,国内外一些学者相继建立了基于基因检测的HIV-1感染诊断方法^{〔2, 3〕},国内关琪等^〔4〕建立了复合巢式PCR方法^〔4〕,然而,这些研究常常只扩增单个基因,而全国艾滋病检测技术规范要求,gag、pol、env中须有≥2个经PCR扩增阳性才能进行诊断^〔5〕,为此,本研究针对gag、pol、env3个基因区设计引物,同步检测3个基因,建立了多重巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,现将结果报道如下。

2006年2月-2007年3月,在广西壮族自治区采集118名HIV-1感染者和48名HIV-1阴性健康成人的血样,全部血样均经免疫印迹法(WB)确认。血样在6h内分离出血浆,-80℃保存。

从LosAlamos HIV database(http://hiv-web.lanl.gov)下载中国HIV-1主要流行毒株序列,针对序列的gag、pol、env3个基因的保守区,用PrimerPremier5.0软件设计多对巢式PCR引物。gag外侧引物GagF2/GagE2引自文献^〔6〕,内侧上游Gag3:5'-CCCAGAAGTAATACCCAT-3',内侧下游Gag4:5'-GTTCCTGCTATGTCACTTC-3'。pol区外侧上游POL1_F:5'-TTCCCTCAAATCACTCTTTG-3',外侧下游POL1_R:5'-GGATGCGGTATTCCTAATT-3',内侧上游POL2_F:5'-GGAAACCAAAAATGATAGG-3',内侧下游POL2_R:5'-GCAAATACTGGAGTATTGTATG-3'。env区外侧上游ENV_1:f5'-GGAGCAGCAGGAAGCACTAT-3',外侧下游ENV_1r:5'-CTCTCCACCTTCTTCTTCGATT-3',内侧上游ENV4a:5'-GTCT-GGTATAGTGCAACAGC-3',内侧下游ENV4b:5'-TGAGTATC-CCTGCCTAACTC-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

用QIAampViralRNAMiniKit(德国Qiagen公司)从血浆中提取病毒RNA,用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(美国Fermentas公司)进行反转录。2轮PCR反应体系均为10×Buffer2μL、25mmol/L脱氧核苷三磷酸(dNTP)1.6μL、3个区的上游引物和下游引物(20μmol/L)各0.2μL、Taq酶(5U/μL)0.4μL、模板4μL、去离子水加至总体积为20μL。第1轮反应条件:94℃5min;94℃30s,56℃30s,72℃1min,3个循环;94℃30s,54℃30s,72℃60s,3个循环;94℃30s,52℃30s,72℃1min,3个循环;94℃30s,50℃30s,72℃60s,3个循环;94℃30s,48℃30s,72℃1min,20个循环;72℃10min。第2轮PCR的延伸时间改为40s,其他均与第1轮相同。每个样本设2管,每次检查同时设置阴、阳性对照及空白对照。

在阳性对照出现目的片段,而阴性对照和空白对照无扩增时,结果才有效,否则需重新扩增。阳性:出现2条或3条目的片段。阴性:3个基因区均无扩增。可疑:出现1条目的条带,需要重新扩增^〔5〕。

用10个已知病毒载量的样本分别稀释为5×10⁶,5×10³,1000,750,500,250,150,75copies/mL8个梯度浓度,按上述方法提取病毒RNA,进行多重巢式RT-PCR,观察其检测下限。

在118份阳性样本中随机抽取30份血浆,在存放10,30,60d时间点,用上述方法分别检测,观察检测结果的稳定性。

图 1

注: Marker: DNA分子量标准; Gx45-49: 阳性样本; Positive: 阳性对照; NC1:阴性对照; NC2: H2O。 图 1 单基因区PCR和多重巢式PCR扩增结果

表 1

表 1 多重巢式PCR与免疫印迹法(W B)的检测结果比较

表 1 多重巢式PCR与免疫印迹法(WB)的检测结果比较

gag、po、lenv扩增产物分别为221,358,505bp。在118份HIV-1阳性样本中,多重巢式RT-PCR判为阳性者114份。对于48份HIV-1阴性样本,多重巢式RT-PCR全部判为阴性。多重巢式PCR方法的灵敏度为96.6%,特异性为100%,多重巢式PCR与WB的检测结果一致的样本有162份(包括HIV-1阳性样本114份,阴性样本48份),一致性为97.6%(162/166)。

多重巢式PCR对已知病毒载量样本的检测结果为:250copies/mL样本的检出率为100%,150copies/mL样本的检出率为80%,而75copies/mL样本的检出率为30%。

30个样本在存放10,30,60d的检出率分别为100%(30/30),100%(30/30)和96.6%(29/30),总检出率(即重复性)为98.9%(89/90)。

HIV-1的gag、pol、env基因及其编码的蛋白是HIV-1检测的重要靶点。免疫印迹试验是HIV抗体确认试验,其检测标准^〔5〕中明确规定:对HIV-1阳性诊断必须检出gag、pol、env3个基因编码主要蛋白条带中的任何2条,只出现1个条带的样本不能作为阳性诊断,即确认试验的HIV-1阳性诊断结果是基于3个结构基因编码产物中的任2个的组合。同样,由于HIV-1的高度变异特性和慢病毒属病毒在这3个结构基因上的相似性,基于单基因的核酸诊断方法出现假阳性或假阴性的几率比较大。本研究借鉴免疫印迹试验检测标准,参照全国艾滋病检测技术规范,用多重巢式RT-PCR方法同步检测HIV-1的gag、pol、env3个结构基因,建立的多重巢式RT-PCR法的灵敏度为96.6%,特异度达100%,灵敏度高于魏民等^〔3〕报道的单基因PCR检测方法,也高于王晓辉等^〔7〕报道的单基因多片段PCR检测方法,而与魏民^〔3〕等人报道的单基因分别检测然后综合判断的方法相近。但本研究建立的方法实现了在同一轮反应中检测3个基因,大大缩短了检测时间。此外,本研究建立的方法重复性为98.9%,最低检测下限约为250copies/mL,97.6%的样本检测结果与免疫印迹试验一致,说明该方法具有灵敏、可靠,快速高效的优点,可为HIV-1母婴垂直传播的诊断、血液筛查以及高危人群监测等提供一种快速、简便、可靠的辅助诊断方法。