饮食结构以及膳食营养与食管癌的发生发展密切相关^{〔1, 2〕}。本研究在四川省盐亭县食管癌高发区饮食对人食管癌细胞增殖影响的研究中^〔3〕,采用模拟健康成人饮食及盐亭饮食配制的饲料喂饲大鼠,观察大鼠血清对人食管癌细胞 Eca-109生长增殖的影响。考虑到大鼠血清本身的活性以及在细胞培养液中的浓度可能对实验结果产生影响,本实验筛选含大鼠血清培养液中大鼠血清的最佳浓度和活性状态,为建立和完善饮食与食管癌关系的血清生理学方法提供科学依据。现将结果报告如下。

细胞培养液(RPMI 1640,美国Gibco公司);新生小牛血清(杭州四季青生物公司);胰蛋白酶、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT,美国Amresco公司);CO2恒温细胞培养箱(日本Sanyo公司);超净工作台(苏州净化设备公司);OLYMPUS- BX50倒置显微镜(日本Olympus公司);Model550酶联免疫检测仪(德国BIO-RAD公司)。

(1)大鼠:清洁级SD雄性大鼠20只,6~7周龄,体重170~190 g (四川大学实验动物中心)。(2)大鼠常规饲料(四川大学实验动物中心):每100 g饲料中碳水化合物、脂肪、蛋白质供能比分别为60%,13%~15%,23%~25%;含膳食纤维4.5 g,灰分7 g。

人食管上皮鳞癌细胞株Eca-109(中科院上海细胞生物研究所);人正常肝上皮细胞株HL7702(四川大学华西基础医学与法医学院免疫教研室)。

(1)大鼠血清制备:常规饲料喂饲大鼠30 d后,经股动脉采取血液样品,37℃静置2 h,3 000 r/min离心10~15 min,吸取血清,同组血清混匀后无菌过滤分装,溶血者弃去,-20℃保存备用。(2)细胞常规培养:Eca-109、HL7702细胞均为贴壁生长细胞,培养方法相同。使用含10%小牛血清(56℃灭活30 min)的RPMI 1640培养液,缓冲液调pH至7.2;开放式单层贴壁培养,温度 37℃、饱和湿度、5% CO₂条件下,置CO₂培养箱中常规培养。

分别制备含2.5%,5%,10%,15%未灭活大鼠血清的RPMI 1640培养液以及同样浓度系列的灭活大鼠血清(56℃灭活30 min)培养液,用含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养液作为对照组。 1.2.3大鼠血清最佳浓度筛选取常规培养至对数生长期的Eca-109细胞,制备成单细胞悬液,染色镜检计数后,用含 10%小牛血清的培养液调整细胞浓度为1.0 × 104/mL,接种于96孔板(100 μL/孔),置于CO2培养箱中培养24 h后弃去培养液,分别加入含不同浓度和活性状态的大鼠血清培养液继续培养,每组设4个复孔。分别于第24,48,72 h各取1板,加入1 mg/mL MTT (50 μL/孔),培养4 h后弃去培养液,加入二甲基亚砜(150 μL/孔)吹打混匀,使紫色结晶甲臜充分溶解后,在酶标仪490 nm波长处测吸光度(A)值。以培养时间为横坐标,A值为纵坐标,绘制细胞生长曲线,比较不同浓度和活性状态的大鼠血清对Eca-109细胞生长增殖能力的影响,筛选最佳作用浓度。

选取最佳浓度的未灭活和灭活大鼠血清,分别培养人食管癌细胞Eca-109和人正常肝上皮细胞HL7702,用含10%灭活小牛血清培养液作为对照,细胞培养及处理方法同上,通过细胞生长曲线进一步分析比较大鼠血清不同活性状态下细胞生长增殖能力的差异。

使用SPSS 13.0软件进行统计分析,进行多样本均数比较的方差分析。

图 1

图 1 大鼠血清对人食管癌细胞Eca-109 生长曲线的影响

各浓度未灭活大鼠血清培养人食管癌细胞Eca-109,细胞基本上呈指数增长趋势,与小牛血清对照组的细胞生长趋势接近(图 1A);灭活大鼠血清中则仅有5%浓度可使Eca-109细胞呈指数增长,接近小牛血清对照组(图 1B)。方差分析结果显示,72 h时各浓度组间差异有统计学意义(F=159.263,P < 0.05),表明含5%大鼠血清的培养液可使Eca-109细胞呈指数增长。两两比较结果显示,含5%未灭活大鼠血清的培养液对细胞生长增殖能力的影响高于其他各浓度组(P < 0.05),与小牛血清对照组最为接近(P > 0.05),最适合Eca-109细胞生长,因此,选择5%大鼠血清做进一步观察。

图 2

图 2 5%浓度大鼠血清对Eca-109(A)、HL7702(B)细胞生长曲线影响

图 2可见,用5%未灭活大鼠血清培养人食管癌细胞Eca-109和人正常肝上皮细胞HL7702,培养72 h时,2株细胞的生长增殖能力均强于5%灭活大鼠血清,差异均有统计学意义(F=37.746,P < 0.05;F=43.399,P < 0.05),与小牛血清对 2株细胞生长增殖的作用接近(P > 0.05)。提示5%相同浓度条件下,未灭活大鼠血清培养液更适合细胞生长。

本研究借鉴中药血清药理学方法^{〔4, 5〕},采用经大鼠体内一系列生物转化之后获得大鼠血清培养液进行人食管癌细胞株和人正常肝上皮细胞株培养,观察其对细胞生长增殖的影响。本实验结果显示,含5%大鼠血清的细胞培养液最适于人食管癌细胞Eca-109生长。本实验所用人癌细胞株与大鼠种属亲缘关系较远,大鼠血清对细胞有一定毒性,浓度不宜过高,否则不利于细胞正常生长。血清灭活可减少其对细胞的毒性,但同时也可降低血清活性,无法真实模拟体内生理环境^〔6〕。本实验结果则表明,未灭活大鼠血清比灭活血清更适于Eca-109细胞生长。

由于同一组织来源的正常食管上皮细胞较难培养,本研究选用人上皮细胞系的正常肝上皮细胞株作为正常细胞对照^〔7〕,保证了实验结果的可靠性和真实性。本方法的意义在于建立与细胞所处内环境相似的血清培养液,使实验结果更具科学性及真实性,可以更深入的探讨饮食在肿瘤发展中的作用。本实验为深入探讨饮食和食管癌关系提供一个新的方法。