近年来,纳米二氧化钛(TiO₂)在化妆品、环境,能源等领域应用广泛,在生物医学领域的研究也取得很大进展^{〔1, 2〕}。由于纳米材料具有不同于常规粗晶粒材料的特性,是否对环境和人类健康具有影响,已引起国际社会的广泛关注^〔3〕。血液相容性是生物材料安全性研究领域里最受关注的核心问题之一,其包括相当广泛的内容,它既有与材料接触后血小板黏附、聚集导致血栓形成,溶血、白细胞减少等细胞水平的反应,又有凝血系统、纤溶系统激活等血桨蛋白水平反应,还有免疫成分改变、血小板受体释放等分子水平的反应^〔4〕。本实验通过动物体内实验方法对纳米TiO₂的血液相容性进行了研究。

TiO₂纳米粒子(杭州万景材料有限公司),平均粒径为25 nm,金红石型。以不饱和树脂促进剂(LCC)为稳定剂,溶胶-凝胶法制备成溶胶,溶胶浓度为215@10-2 m ol/L。TiO₂纳米溶胶(武汉华中科技大学生命科学与技术学院)。实验前预处理:将TiO₂纳米溶胶置60 °C水浴中10 h,然后37 °C水浴过夜。反复3次。灭菌处理。小瓶分装,4 °C保存。动物模型采用日本大耳白家兔,SPF级,雄性,体重2.3~2.65 kg (武汉华中科技大学同济医学院实验动物中心),许可证号:SYXK (鄂)2004-0028。兔PF-4 ELISA试剂盒(Rabbit Platelet Factor 4,PF-4 ELISA Kit)(武汉中美科技有限公司)。

CA-7 000全自动血凝分析仪(日本Syemex公司);配套试剂(德国DADE BEHRING公司);SYSM EX KX21全自动血细胞分析仪(日本Syemex公司);高速离心机(美国Sigm a公司);普通双目显微镜(日本Olympus公司);EXL800全自动酶标仪(美国Bil-TEK公司);低温冰箱(日本Sanyo公司);电子恒温水浴箱(上海医疗器械厂)。

取家兔24只,随机分为低剂量组、高剂量组、稳定量组、稳定剂LCC组和阴性对照组,每组5只。分别从耳缘静脉注射TiO₂纳米溶胶2.3 mL/kg (含TiO₂纳米粒子7.4 m g/kg)、TiO₂纳米溶胶4.6 mL/kg (含TiO₂纳料粒子14.8 mL/kg)、LCC4.6 mL/kg、生理盐水4.6 mL/kg。分别在给药的0,1,2,4,8,24,48 h从耳缘静脉采血2mL,加入含有0.109 mL枸橼酸钠抗凝管中,30 m in内在4 °C下于3 500 r/m in离心4 m in,取上层血浆以CA-7 000全自动血凝分析仪检测凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)和血浆纤维蛋白原(FIB)含量。

动物分组及处理同上。分别在给药的0,1,2,4,8,24,48 h从耳缘静脉采血2.7 mL,加入含有316 mg乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中,30 m in内在4 °C下于1 000 r/m in离心15 min,取上层血浆分装保存于-20 °C待测。应用ELISA试剂盒测定各组血浆标本中血小的因子4(PF-4)的含量。利用EXL800全自动酶标仪测定A值。

动物分组及处理同上。分别在给药的0,1,2,4,8,24,48 h从耳缘静脉采血2 mL,加入含有3.6 m gEDTA抗凝管中,以全自动血细胞分析仪计数RBC、W BC、PLT。分别在注射0和48 h时,在各组动物耳缘静脉采血做血涂片,苏木素-伊红(HE)染色后光镜下观察血细胞形态并拍照(400x)。

应用SPSS131 0软件进行统计学分析。组内及组间采用两因素方差分析。

表 1

表 1 不同时间点各组动物PT值比较

表 1 不同时间点各组动物PT值比较

表 2

表 2 不同时间点各组动物FIB值比较

表 2 不同时间点各组动物FIB值比较

与阴性对照组对应时间点比较,稳定剂组、低剂量组、高剂量组各时间点PT、APTT和FIB差异均无统计学意义(P > 0.05);与稳定剂组对应时间点比较,低剂量组、高剂量组各时间点PT、APTT和E IB差异均无统计学意义(P > 0.05);低剂量组、高剂量组各时间点PT、APTT和FIB差异均无统计学意义(P > 0.05);给予相同处理的各组内不同时间点之间PT、APTT和血浆EIB差异均无统计学意义(P > 0.05),且随时间变化无趋势性变化。

表 3

表 3 不同时间点各组动物血浆PF-4含量比

表 3 不同时间点各组动物血浆PF-4含量比

与阴性对照组对应时间点比较,稳定剂组、低剂量组、高剂量组各时间点血浆PF-4差异均无统计学意义(P > 0105);与稳定剂组对应时间点比较,低剂量组、高剂量组各时间点血浆PF-4差异均无统计学意义(P > 0.05);低剂量组、高剂量组各时间点血浆PF-4差异均无统计学意义(P > 0.05);给予相同处理的各组内不同时间点之间血浆PF-4差异均无统计学意义(P > 0105),且随时间变化无趋势性变化。

与阴性对照组对应时间点比较,稳定剂组、低剂量组、高剂量组各时间点RBC、W BC和PLT差异均无统计学意义(P > 0.5);与稳定剂组、低剂量组、高剂量组各时间点RBC、WBC和PLT差异均无统计学意义(P > 0.5);低剂量组、高剂量组各时间点RBC、WBC和PLT差异均无统计学意义(P > 0.05);注射后随时间推移,各组内RBC、WBC和PLT计数稍逐步有下降趋势,但给予相同处理的各组内不同时间点之间RBC、WBC和PLT差异均无统计学意义(P > 0.5)。

显微镜下观察各组0及48 h时血涂片发现,给予不剂量的TiO₂纳米粒溶胶和稳定剂后,各种血细胞形态均未见明显变化。其中稳定剂组、低剂量组、高剂量组血涂片与对应时间点阴性对照组血涂片比较,各组0与48 h血涂片比较,红细胞分类大致相当,未见幼稚白细胞,白细胞内未见中毒颗粒;血小板形态、数量未见明显差异,均未见巨大血小板。

本研究发现,TiO₂纳米粒对家兔的PT、APTT及FIB均不产生影响,可能由于TiO₂的等电点为6.2,在血液pH714的环境下,呈负电性,具有吸附血液中凝血途径重要因子Ca²⁺的作用^〔5〕,因而具有抗凝血性。另一方面,当血液与材料表面接触一定时间后,血液中FIB含量的变化越小,说明材料表面对纤维蛋白原分子的吸附性越低。可以认为,TiO₂纳米粒子表面对血浆蛋白的吸附性极低。

最新美国国立心肺血液所(NHLB I)血液-材料相互作用指南中增加了一些更为灵敏的指标,如PF-4、B-TG、GMP-140等。其中PF-4是由血小板A-颗粒分泌的巨核细胞/血小板的特异性蛋白、在病理状态下,其浓度可增加1 000倍以上,反映血小板聚集性增强^〔6〕,加速纤维蛋白单体的聚合,促进血液凝固^〔7〕。因此,PF-4被认为是血液高凝状态的最敏感指标^〔8〕。本实验对血浆PF-4含量的检测结果表明,TiO₂纳米粒对血小板无激活作用,不会引起异常高凝现象。

此外,通过对各类血细胞计数进行检测发现,同组各时间点间和同一时间点各组间RBC、WBC和PLT计数差异均无统计学意义。H E染色的血涂片也发现,各组0与48 h血细胞形态下明显变化,均未见异常细胞,说明TiO₂纳米粒不会激活血浆中白细胞导致白细胞吸附和引起溶血。与既往报道的体外实验中TiO₂纳米溶血试验呈阴性、溶血率< 1%一致192,符合医学标准规定的植入物溶血率< 5%的要求。