白藜芦醇是广泛存在于葡萄、花生和多种药用植物中的一种多酚类化合物, 能通过多种途径抑制肿瘤细胞的发生和发展^〔1〕, 但其作用机制尚不十分清楚。胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一, 目前仍缺乏有效的预防方法。本研究发现, 白藜芦醇能明显抑制胃癌细胞增殖^〔2〕。在此基础上, 本研究进一步探讨白藜芦醇对胃癌细胞株细胞周期的影响及其作用机制, 为白藜芦醇应用于胃癌的防治提供理论依据。

超级新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所); RPMI 1640培养粉(美国Gibco公司); 胃癌细胞株MGC-803 (本室储备); 白藜芦醇粉剂(西安赛德公司, 质量分数为98%); 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT, 美国Sigma公司)。

白藜芦醇用二甲基亚砜(DMSO, 美国Sigma公司)溶解, 过滤灭菌, 实验前以RPMI 1640培养液稀释成不同浓度, DMSO终浓度 < 0.1%。MTT临用前用pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)配成5 g/L溶液。人胃癌细胞株MGC-803培养在含10%热灭活(56 ℃, 30 min)小牛血清的RPMI 1640完全培养液中, 置37 ℃, 5% CO₂培养箱, 2~3 d传代1次。

设白藜芦醇低高剂量组(25, 50μg/mL); 空白对照组。每组实验用MGC-803细胞的浓度为5 ×10⁵个/mL。实验步骤: (1)细胞生长抑制试验:方法参照文献^〔2〕。(2)集落形成试验:取处于对数生长期的单层培养细胞用2 g/L胰酶、2 g/L乙二胺四乙酸(EDTA)的等份混合液消化后, 吹打制成单细胞悬液, 进行活细胞计数, 用完全培养液稀释至细胞数为600个/mL。取1 mL细胞稀释液和4 mL完全培养液分别加入6孔培养板(直径为35 mm), 3孔为1组, 加药后放入体积分数为5%的CO₂、37 ℃温箱中静置培养7 d, 弃去培养液, 生理盐水洗2遍, 晾干, 甲醇固定15 min, 去掉甲醇, 姬姆萨液染色10 min, 自来水冲洗晾干, 显微镜下计数含50个细胞的集落数量。

实验设组同1.3, 取10⁶个细胞接种于100 mL培养瓶内, 加药后培养24 h收集细胞, PBS液洗2次, 缓慢加入预冷的70%乙醇1 mL, 固定1 h。用PBS洗2次, 将等体积的细胞悬液和碘化丙碇(P I)染液混合, 4 ℃放置30 min, 将样本放入流式细胞术(FCM)实验室的样品室, 以激发波长488 nm测定, 并用Modifit LT 2.0软件分析细胞周期。

实验用药及细胞培养同1.3, 采用酚/氯仿抽提一步法提取对照组和实验组胃癌细胞RNA, 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定细胞凋亡抑制基因-2 (bcl-2)、增殖基因c-myc的mRNA表达水平。RT-PCR反应体系及反应条件按文献^〔3-4〕。bcl-2、c-myc基因和内对照β-actin基因扩增产物的长度分别为280, 180和539 bp。反应结束后取10μL产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳、紫外灯下观察。应用Gel Doc 1000凝胶图像分析仪(美国Bio-Rad公司)分析, 以与内对照基因荧光强度的比值作为各基因mRNA表达的相对含量。

应用SPSS 10.0统计软件进行分析, 多组均数比较用方差分析法, 均数两两比较用Dunnett-t检验。

用药24 h后, 低、高浓度白藜芦醇对胃癌细胞增殖抑制率分别为6.9%及17.6%, 差异均有统计学意义(P < 0.005)。

与空白对照组比较, 白藜芦醇低、高剂量组对胃癌细胞集落形成的抑制率分别为27.98%和63.39%, 差异均有统计学意义(P < 0.005)。

流式细胞仪分析表明, 空白对照组细胞的DNA在G₀/G₁期、S期、G₂/M期分别为42.4%, 37.7%, 19.9%, 表明空白对照组DNA合成期细胞比例高, 细胞增殖能力强。白藜芦醇低剂量组24h后G₀/G₁期、S期、G₂/M期细胞分别为45.2%, 34.6%和20.2%, 细胞周期未见明显改变; 高剂量组24 h后各期细胞分别为50.4%, 15.3%和34.3%, 可见G₀/G₁期细胞明显增多而S期细胞明显减少, 表明随着用药时间延长, 可使肿瘤细胞停滞于G₀/G₁期, 细胞生长停滞。

用药24 h后, 与空白对照组比较, 高剂量白藜芦醇用药组bcl-2和c-myc基因mRNA表达降低, 差异有统计学意义(P < 0.005)。

表 1

表 1 白藜芦醇对 bcl-2和 c-myc基因 mRNA表达影响(x±s, n=3)

表 1 白藜芦醇对 bcl-2和 c-myc基因 mRNA表达影响(x±s, n=3)

图 1

注：M：Marker；1：内对照β-actin；2：空白对照组；3：白藜芦醇低剂量组；4：白藜芦醇高剂量组。 图 1 bcl-2基因mRNA表达的RT-PCR检测

图 2

注：M：Marker；1：内对照β-actin；2：空白对照组；3：白藜芦醇低剂量组；4：白藜芦醇高剂量组。 图 2 c-myc基因mRNA表达的RT-PCR检测

通过影响肿瘤细胞的细胞周期而抑制其增殖是许多植物单体抗肿瘤的作用途径之一^〔5〕。本研究发现, 低、高剂量白藜芦醇均能明显抑制胃癌MGC-803细胞增殖, 并使胃癌细胞周期阻滞在G₀/G₁期, 表明其抑制胃癌细胞增殖可能与其使细胞周期停滞在G₀/G₁期有关, 与文献报道一致^〔6〕。c-myc是细胞增殖的重要调节基因, 在多数人类肿瘤细胞中均有c-myc基因的高表达^〔7〕, 其编码的产物C-myc蛋白能促进肿瘤细胞增殖^〔8〕, 凋亡抑制基因bcl-2的表达增高可促进其增殖作用^〔9〕。本研究中, 高剂量白藜芦醇组的c-myc和bcl-2的mRNA表达水平明显低于对照组, 提示白藜芦醇能够通过下调c-myc和bcl-2基因mRNA表达, 从而抑制胃癌细胞的增殖。但c-myc基因mRNA的表达抑制是否通过bcl-2发挥作用及二者相互作用的关系, 尚有待进一步研究。