2009, Vol. 25
近年来, 全球结核病的发病率呈增高趋势。我国肺结核病死率约为13.89 /10万, 占各种疾病死亡原因的第9位, 并呈上升趋势〔1〕。结核病发生、发展及转归不仅取决于细菌的毒力和数量, 在很大程度上取决于机体的免疫状态。机体抗结核免疫主要是细胞免疫, 决定细胞免疫强弱的主要是T淋巴细胞亚群数量及功能。结核病虽是由结核杆菌感染引起的传染病, 但细胞介导免疫在发病机制中有相当重要的作用。近十几年的研究也证明CD4+和CD8+ T细胞是抗结核保护性免疫的重要记忆和功能细胞〔2〕。尽管对结核病免疫研究较多, 但CD4+、CD8+及双阳性(DP) T细胞在参与细胞免疫反应中的作用仍不十分明确。本研究通过流式细胞仪同时检测CD4+、CD8+及D P细胞所分泌的细胞因子IFN-γ、IL-2的水平, 以探讨结核病CD4+、CD8+及D P免疫细胞在参与细胞免疫反应中的作用。现将结果报告如下。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物实验用清洁级健康雄性昆明小鼠30只, 体重17~22 g (江西中医学院实验动物科学部), 经结核菌素进行皮试, 观察72 h, 试验阴性小鼠用于实验研究。
1.1.2 结核分枝杆菌的制备结核分枝杆菌H37Rv (中国生物制品鉴定所), 在动物体内恢复毒力后使用。刮取改良罗氏培养基上生长2周的H37Rv标准株, 称取湿菌重10 mg, 加0.05% Tween 80生理盐水磨菌制成2 mL的菌悬液(5 mg/mL), 并稀释成1 × 106 /mL菌落数备用。
1.1.3 主要试剂结核菌素(PPD) (上海生物制品研究所); 单抗(PE)标记的大鼠抗小鼠IFN -γ、IL-2单抗以及相应的同型对照抗体、红细胞裂解液(美国B ioscience公司)。大鼠抗小鼠CD 3PerCP、CD 4FTTC、CD 8A PC单抗以及相应的同型对照抗体、Cytofix /Cytoperm TM Plus Fixation / Permeabilization试剂盒(美国BD公司)。
1.2 方法 1.2.1 实验动物分组按体重相近的原则将30只实验小鼠随机分成2组。对照组给予0.1 mL生理盐水经尾静脉注射; 结核病组给予结核分枝杆菌H37Rv菌悬液0.1 mL经尾静脉注射, 饲养6周, 制作结核病鼠模型。
1.2.2 结核病小鼠感染模型的建立结核病组每只小鼠经尾静脉注射结核分枝杆菌H37Rv菌悬液0.1 mL (实际含湿菌量0.1 mg/只), 饲养6周, 制作结核分枝杆菌感染模型。为便于对照观察, 建立了结核病鼠模型感染组(10只小鼠), 于4和6周时各处死5只小鼠后取出肺组织做苏木精-伊红染色(hem atoxylin-eosin staining)和Ziehl-Neelsen法抗酸染色。结果发现, 感染6周的小鼠均见结核病灶处类上皮细胞和巨噬细胞聚集成团, 周围有淋巴细胞浸润, 个别结节内可见多核巨细胞, 抗酸染色阳性, 故确定6周构建结核病鼠模型成功。
1.2.3 取血每只小鼠眼球内眦取血1.5 mL, 肝素抗凝, 加等体积磷酸盐缓冲液(PBS)稀释全血, 充分混匀, 分为A、B管。
1.2.4 细胞染色取200 μL全血, 加入CD 3PerCR / CD 4FTTC /CD 8A PC各20 μL, 室温避光30 min。洗涤2次后, 重新悬浮细胞, 加入2 mL红细胞裂解液, 轻轻摇匀, 室温避光孕育18 min; 再洗涤2次后, 重新悬浮细胞, 细胞内γ -干扰素、白介素-2染色; 加入250μL Fixation / Perm eabilization液4 ℃, 避光通透20 min, 洗涤后加入特异性胞内标记单抗(Interferon -γ-PE或Interleukin-2-PE), 4 ℃避光孵育30 min, 洗涤2次, 悬浮细胞, 待机检测。
1.2.5 流式细胞仪分析根据T细胞表达CD 3分子的特点, 将门设在CD 3阳性淋巴细胞群, 再根据CD 4和CD 8分子表达与否再设3个门, 将T细胞分为3个主要亚群, 即CD4+ T、CD8+ T和DPT细胞, 再分析IFN-γ和IL-2的表达。检测经FACS Caliur流式细胞仪, 用Cell quest软件分析, 打出散点图, 以荧光抗体染色阳性细胞百分率记录结果。
1.3 统计分析采用SPSS 11.0统计软件进行分析。结核病组与对照组比较CD4+ T、CD8+ T、DPT细胞内IFN-γ和IL-2阳性细胞百分率。均值采用t检验; 计量资料采用x±s。
2 结果 2.1 结核病小鼠模型结核病组10只小鼠经解剖证实其肺内有不同程度的结核病灶, 经肺组织切片可见结核病灶处类上皮细胞和巨噬细胞聚集成团, 周围有淋巴细胞浸润, 个别结节内可见多核巨细胞(图 1);经抗酸染色可见大量红色短小结核杆菌(图 2)。
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图 1 病变肺(HE,200×) |
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图 2 肺组织(HE,1000×) |
2.2 2组T细胞亚群比较(表 1)
CD4+、CD8+均显著降低, D P显著升高, 差异有统计学意义。
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表 1 2组 T细胞亚群比较(x±s) |
2.3 表达γ-干扰素T细胞亚群比较(表 2)
结核病鼠表达IFN-γ的CD4+ T细胞占同亚群细胞总数的比值和CD4+ /CD8+比值均高于对照组, 差异有统计学意义(P < 0.05)。表达IFN-γ的CD4+ T细胞是表达IFN-γ的CD8+ T细胞与DPT细胞之和的6倍左右。在IFN-γ的表达方面, CD4+ T细胞是最主要的T细胞。
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表 2 表达 γ-干扰素 T细胞亚群比较(x±s) |
2.5 表达白介素-2的T细胞亚群比较(表 3)
结核病鼠表达IL-2的CD4+ T细胞、DPT细胞均明显降低, 表达IL -2的DPT细胞占相应DPT细胞总数的比值明显降低, 差异均有统计学意义。表达IL-2的CD4+ T细胞是表达IL-2的CD4+ T细胞与DPT细胞之和的6倍左右。结核病鼠T细胞表达IL-2水平是降低的。但在IL-2表达方面, CD4+ T细胞仍然是最主要的T细胞。
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表 3 表达白介素 - 2T细胞亚群比较(x±s) |
3 讨论
本研究显示, 结核病鼠CD4+、CD8+系列明显降低, 这可能是结核病鼠进展期早期, 首先引起以巨噬细胞和中性粒细胞浸润为主的非特异性炎症反应所致, 缺乏抗结核免疫的特异性, 所以呈现出T淋巴细胞受到相对抑制的现象, 与Frank W 〔4〕报道一致。然而, DPT细胞显著升高, 表明此时抗结核保护性T细胞免疫已启动。Bapi Pahar等〔5〕发现, 恒河猴双阳T细胞具有记忆表型, 能产生和CD4+ T细胞几乎同样的细胞因子。雷建平等〔6〕研究也显示, 卡介苗(BCG)引发的免疫学重要改变是DPT细胞升高, 提示DPT细胞在防止结核感染后发病中起到了重要免疫保护作用。
本研究还显示, CD4+、CD8+、DPT细胞均可不同程度地表达IFN -γ, 但CD4+ T细胞是表达IFN-γ的主要T细胞。由于IFN -γ升高与结核病的进展相关, 但作为一种炎症反应因子, 其与抗结核特异性保护性免疫的关系尚不能确定, 从本研究结果看, 其与非特异性免疫关系可能更相关。结核病鼠CD4+、DPT细胞在结核病早期免疫应答过程中表达IL -2水平降低, 提示T细胞保护性免疫反应可能受到一定程度的抑制。徐纪茹及刘树兵等〔7-8〕报告, 活动性肺结核患者外周血T淋巴细胞受刺激后, IL-2产生水平及IL-2R表达水平均降低, 患病时间越长越低越明显。
本研究反映了结核病进展期早期T细胞亚群表达IL -2、IFN -γ的状态, 尚不能准确判断这2种细胞因子与结核病保护性免疫关系, 细胞因子与结核病免疫相关性有待研究。
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