子宫颈癌居妇科恶性肿瘤的第一位, 严重危害妇女的生命健康。新疆维吾尔族妇女子宫颈癌的患病率远高于汉族和其他民族^〔1〕。研究发现, 子宫颈鳞癌的发生可能与死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase, DAPK)基因启动子甲基化有关^〔2-3〕。因此, 本研究对60份新疆维吾尔族妇女宫颈癌组织标本及40份宫颈癌阴性宫颈组织标本中的DAPK基因启动子甲基化进行检测, 为维吾尔族妇女子宫颈鳞癌的早期诊断筛选新的生物学指标。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

从新疆喀什地区人民医院、阿克苏人民医院、自治区人民医院共收集60份病例标本作为病例组, 均经组织病理检查确证为子宫颈鳞癌, 且患者术前均未进行化疗或放疗; 对照组40份取自上述医院妇科门诊炎症活检组织、子宫肌瘤手术后的子宫颈组织以及健康体检者子宫颈脱落细胞, 经临床病理学检查确诊为宫颈癌阴性的宫颈组织。

1.2 主要试剂和仪器

基因组DNA提取试剂盒(上海生物工程公司); 甲基化修饰试剂盒(美国CHEMICON公司); 甲基化、非甲基化引物(上海生物工程公司合成); PCR聚合酶(大连宝生物公司); 离心机(德国Sigma公司); PCR仪(德国Biometra公司); DYY-Ⅲ稳压稳流电泳仪(北京六一实验仪器厂); 凝胶成像系统(美国Synoptics LTD公司)。

1.3 甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific PCR, MSP)

(1)组织DNA提取:DNA采用基因组DNA抽提试剂盒SK1252(上海生工公司)抽提组织DNA。(2) DNA亚硫酸氢盐修饰:参照基因组修试剂盒(CpGenome DNA Modification kit)手册步骤对DNA进行亚硫酸盐处理修饰并纯化, 修饰后的DNA置于-80℃保存。(3) MSP检测:由上海生物工程合成2对引物, DAPK甲基化引物:上游引物:5-GGATAG TCG GATCGAGTTAACGTC-3, 下游引物:5-CCCTCCCAA ACG CCGA-3, 片段长度98 bp; DAPK非甲基化引物:上游引物:5-GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3, 下游引物:5-CAA ATCCCTCCCAAACACCAA-3, 片段长度106 bp。反应体系(25 μL):ddH2O15.2 μL, 10 ×PCRbuffer2.5 μL, MgCI2 1.0 μL, 脱氧核苷酸混合物1.0 μL, 上、下游混合引物2.0 μL, DNA模板3.0 μL, DNA聚合酶0.3 μL (大连宝生物公司), 反应条件:94℃ 5 min, 然后94℃ 60 s, 60℃ 60 s, 72℃ 60 s, 35个循环后, 72℃ 10 min。4.0℃保存。PCR护增时以正常子宫颈组织作正常对照, 以等量去离子双蒸水代替模板DNA作为阴性对照。用体外高甲基化DNA (In vitro hypermethylation DNA, IVD)(美国Intergen公司)作为阳性对照。

1.4 统计分析

采用SPSS13.0软件进行统计分析。

2 结果 2.1 DAPK基因启动子甲基化检测结果比较(表 1)

病例组和对照组平均年龄分别为(45.7±8.36)岁和(43.3±11.7)岁。病例组检出DAPK基因启动子甲基化38例, 甲基化率为63.3%;对照组检出DAPK基因启动子甲基化3例, 甲基化率为7.5%, 2组间比较差异有统计学意义(χ²=30.929, P < 0.001)。

3 讨论

凋亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase, DAPK)是一种钙离子/钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 具有调节细胞的生存和凋亡、抑制细胞移动及抑制肿瘤的作用, 当DAPK基因启动子甲基化后, 表达降低或消失, 有可能导致肿瘤的发生。本研究采用MSP法对DAPK基因启动子区CpG岛甲基化情况进行检测, 发现病例组子宫颈鳞癌甲基化率与对照组差异有统计学意义, 与赵先兰^〔2〕及DongSM等^〔3〕报道结果不一致。研究发现^〔3〕, DAPK在宫颈鳞癌中的甲基化率高于宫颈腺癌。因而, 通过对DAPK基因启动子甲基化检测, 可能为子宫颈癌的组织学分型提供依据。李军^〔4〕, 陈少泽(5)等研究发现, 维吾尔族妇女子宫颈鳞癌组织中rassf1a、MGMT基因存在不同程度甲基化。因此, rassf1a、MGMT、DAPK等多个基因的甲基化联合检测可能作为维吾尔族妇女子宫颈鳞癌早期诊断的生物学指标, 但有待深入研究。