先天性心脏病(congenital heart disease, CHD, 先心病)的病因非常复杂, 至今尚未完全明了, 目前较普遍的观点认为CHD的发生绝大多数是遗传因素-环境因素相互作用的结果^〔1〕。5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR基因为同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)代谢途径关键酶, 由于MTHFR基因677C→T改变, 导致该酶活性降低, Hcy再甲基化为甲硫氨酸受阻, 从而引起高Hcy血症, 具有胚胎毒性, 是一种能损害或干扰早期心血管生长发育的危险因子^〔2〕。为了探讨先天性心脏病与孕期化学物接触、MTHFR基因多态性的关系和交互作用, 本研究于2006-2008年选择山东省泰安市和济宁市收治的先心病患儿144例进行了观察。现将结果报告如下。

收集泰安市中心医院、泰山医学院附属医院、泰安市妇幼保健院、济宁医学院附属医院4所不同层次的综合医院收治, 经临床诊断、彩色多普勒超声心动图诊断确诊为先天性心脏病, 排除心脏血管以外畸形的144例患儿作为病例组; 选择来自同一医院、经临床、心脏彩色超声检查确定无先心病及其他畸形的住院患儿168例, 作为对照组。

自行设计幼儿出生质量相关因素调查表%, 内容包括幼儿一般情况、父母在孕期及孕前接触工农业用化学物的种类、接触的方式、接触的频率、接触的时间等方面, 若频率≥1次/周, 连续4周或接触时间超过7 d, 结果判定为经常接触。由调查员采用面访法向幼儿的父母调查并填写调查表。

抽取幼儿外周静脉血2 mL, 乙二胺四乙酸(EDTA)-Na₂抗凝, 置-70℃冰箱备用。采用全血DNA提取试剂盒(大连宝生物公司), 按说明书操作。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测MTHFR基因。(1)引物:上游引物为5'-TGA AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA-3', 下游引物为5'-AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG-3'。(2) PCR反应体系:总体积50 L, 其中, 灭菌双蒸水29 μL, 10×PCR反应缓冲液5 μL, MgCl₂ 4 μL, dNTP 4 μL, 引物各1 μL, DNA 5 μL, Taq酶1 μL。上述液体混匀后, 3000 r/min离心15 s。(3) PCR反应条件: 95 ℃预变性5 min; 接94 ℃变性30 s, 55 ℃复性39 s, 72 ℃延伸30 s, 40个循环; 72 ℃终末延伸7 min, 最后置于4 ℃保存。(4)酶切与酶切产物鉴定:取10×限制性内切酶反应缓冲液2.0 μL, PCR扩增产物17 μL, 限制性内切酶Hinf Ⅰ 1 μL, 组成20 μL的酶切反应体系, 37 ℃消化酶切24 h, 取出酶切产物; 采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压为5~15 V / cm, 1.5 h)对酶切产物片段进行分离, 溴化乙锭(EB)染色, 紫外透射分析仪检测酶切产物及大小, 进行图片拍摄, 分析基因型。(5)因素及交互作用分析:参照文献〔3〕, 计算各因素相对危险度(OR); 选用相加模型进行交互作用分析, 使用交互作用指数(the synergy index, S)进行定性分析, 若S > 1, 说明A、B两因素之间具有正相加模型交互作用, 两因素同时存在时效应增强, 即协同作用; 若S < 1, 说明A、B两因素之间具有负相加模型交互作用, 两因素同时存在时效应减低, 即拮抗作用。S绝对值越大, 则说明两因素之间交互作用越强; 使用归因交互效应(RERI)、归因交互效应百分比〔AP (AB)〕、纯因子间归因交互效应百分比〔AP^* (AB)〕等参数进行定量分析: RERI表示交互作用所引起的相对效应的大小, 绝对值越大, 说明两因素之间交互作用越强; AP (AB)表示因素A、B联合效应中归因交互效应所占的比重, AP (AB)绝对值越大, 则说明两因素之间的交互作用越强; AP^* (AB)表示仅仅因为AB两因素所引起的效应中(即扣除本底效应)由于交互效应所占的百分比。

应用SAS 8.2软件进行统计分析, α=0.05。单因素分析采用t检验和χ²检验; 多因素分析及混杂因素调整采用非条件Logistic回归分析。

病例组144例中, 男性78例, 女性66例, 平均年龄(2.68±1.46)岁。对照组168例中, 男性96例, 女性72例, 平均年龄(2.79±1.96)岁; 2组性别、年龄构成差异均无统计学意义(χ²=0.278 4, P=0.597 7; t=0.566 8, P > 0.05)。对照组MTHFR基因型频率的观察值与期望值比较, 差异无统计学意义(χ²=4.385, P=0.112), 表明MTHFR基因型频率达到遗传平衡, 具有人群代表性。

表 1

表 1 MTHFRC677T基因多态性与先心病关系

表 1 MTHFRC677T基因多态性与先心病关系

2组间TT基因型频率差异及2组间等位基因分布差异均有统计学意义(χ²=22.326, P < 0.001; χ²=20.515, P < 0.0001), 表明幼儿携带TT基因型与先天性心脏病的发生有关联; 单因素分析结果显示, MTHFR677TT基因型与先心病的关联强度为OR=3.215 (95% CI=1.958~5.280)。

调查得知, 病例组母亲孕期化学物经常接触率为15.28% (22 /144), 其中职业性接触7例, 生活性接触15例, 对照组孕期化学物经常接触率为7.74% (13 /168), 其中职业性接触4例, 生活性接触9例, 差异有统计学意义(χ²=4.433, P=0.035 2), OR=2.150 (95% CI=1.041~4.442);调整父母年龄、胎龄混杂因素后, 孕期化学物接触与先心病的OR=2.684 (95% CI=1.334~4.520)。

表 2

表 2 MTHFR677TT基因型和孕期化学物接触的交互作用分析

表 2 MTHFR677TT基因型和孕期化学物接触的交互作用分析

以MTHFR677TT基因型为突变型, 记为“+ +”, CC + CT为未突变基因型, 记为“-”, 按照母亲孕期经常接触化学物与否, 分别记为“+”、“-”, 进行基因-环境两类因素的交互作用分析。交互作用分析结果显示, 各因素单独作用和联合作用的OR值差异均有统计学意义, 调整混杂因素前后的交互作用指数(S)分别为3.184, 3.195, 表明MTHFR677TT基因型与孕期化学物接触之间在先心病发病中具有正交互作用, 即两因素同时存在时致病效应增强。调整混杂因素前后, RERI分别为4.938, 6.126; AP (AB)分别为60.23%, 61.77%; AP^* (AB)分别为68.59%, 68.70%, 可见交互作用的效应量及其在联合作用中所占的比例均较大, 调整后的效应大于调整前。

本研究表明, 携带TT基因型的个体发生先天性心脏病的风险是CC或CT基因型个体的3.215倍(95% CI=1.958~5.280), 提示MTHFR677TT基因型可能是儿童CHD易感性的重要遗传标志。

随着越来越多的化学物质在工农业中的使用, 化学物质对先心病的致畸作用也受到关注。动物实验流行病学调查也证实了化学毒物与先心病的发生存在相关性。一些研究提示, 孕期孕妇接触化学毒物可导致先心病的发生^〔4-5〕。本研究结果表明, 母亲孕期接触工农业用的化学物是先心病的危险因素, 调查所得的化学物主要是农药类和工业有机溶剂类, 调整混杂后, 关联强度差异有统计学意义, 因此, 在优生咨询时应明确孕妇要提高个人的防护意识, 避免有毒物质的接触。

先天性心脏病病因未明, 目前普遍的观点认为先心病是内在遗传易感因素和环境致畸原共同作用所导致^〔6〕。本研究交互作用分析发现, 调整混杂因素后, MTH FR677TT基因型和孕期接触化学物之间均具有正相加交互作用, 交互作用效应量及其在联合效应中所占的比例较大, 表明在MTH FR677TT基因型的遗传背景下同时暴露于有毒化学物, 子代发生先心病的危险性大大增加。建议采取高危人群干预策略, 对携带易感基因型的高危个体, 积极控制相应的环境因素, 可以起到降低疾病发生的目的。