中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (7): 847-849   PDF    
引用本文
姜丽平, 戴红, 耿成燕, 杨月, 吴涛, 曹军, 仲来福. 大气可吸入颗粒物致HepG2细胞DNA损伤[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(7): 847-849.
JIANG Li-ping, DAI Hong, GENG Cheng-ya, et al. Study on DNA damage of HepG2 cell induced by inhalable particulate matter[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(7): 847-849.
大气可吸入颗粒物致HepG2细胞DNA损伤
姜丽平1, 戴红2, 耿成燕1, 杨月3, 吴涛3, 曹军2, 仲来福1     
1. 大连医科大学-中日合作医药科学研究所, 辽宁 大连 116044;
2. 大连医科大学劳动卫生与环境卫生学教研室;
3. 大连市环境科学学会
收稿日期: 2008-11-24
基金项目: 国家自然科学基金(30771820);大连市环保护局科技计划项目(HK200501-02)
作者简介: 姜丽平(1964-), 女, 辽宁大连人, 高级实验师, 硕士, 主要从事毒理学研究。
通讯作者: 仲来福
摘要: 目的 研究大气可吸入颗粒物(PM10)致人肝细胞瘤细胞(HepG2) DNA损伤及其可能机制。 方法 单细胞凝胶电泳(SCGE)试验检测细胞DNA链断裂；2'，7'-二氢二氯荧光素(DCFH)法测定细胞内活性氧水平；免疫组化方法测定8-羟脱氧鸟苷(8-OHdG)在细胞内的表达水平；免疫细胞化学法检测细胞内核转录因子NF-κB p65蛋白表达水平。 结果 大连市4个监测点PM10有机提取物致HepG2细胞DNA链断裂作用存在地点和季节差异；7.5~30μg/mLPM10有机提取物作用HepG2细胞1h后，尾DNA%增大，呈剂量依赖关系.HepG2细胞与7.5~30μg/mL的PM10有机提取物接触1h后，可引起细胞内ROS水平表达的明显增加；7.5~30μg/mL的PM10有机提取物作用于HepG2细胞3h后，细胞内8-OHdG水平的表达增强；HepG2细胞与30μg/mL的PM10有机提取物接触24h后，NF-κB p65蛋白表达水平明显增高。 结论 PM10有机提取物可引起体外HepG2细胞DNA链断裂；DNA链断裂水平随不同季节和不同监测点而异；PM10引起DNA损伤的机制可能是细胞内ROS生成增多，8-OHdG表达增高及NF-κB p65蛋白表达水平升高而导致的氧化性DNA损伤。
关键词： PM10     HepG2细胞     DNA链断裂     氧化性DNA损伤    
Study on DNA damage of HepG2 cell induced by inhalable particulate matter
JIANG Li-ping, DAI Hong, GENG Cheng-ya, et al     
China-Japanese Joint Institute for Medical and Pharmaceutical Science, Dalian Medical University (Dalian 116044, China)
Abstract: Objective To investigate DNA damage induced by inhalable particulate matter (PM 10) and its mechanisms in HepG2 cells. Methods DNA strand breaks induced by extractable organic matter of PM 10 was assessed by single cell gel electrophoresis (SCGE) assay. Intracellular generation of reactive oxygen species (ROS), expression of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) and protein expression of NF-κB p65 were estimated by 2, 7-dichlorofluorescein (DCFH), immunocytochemistry staining and Western blot, respectively. Results ignificant differences in percent of tail DNA induced by the extractable organic matter of PM 10 were revealed between samples collected in summer and winter seasons and from different monitoring sites. The percent of tail DNA in HepG2 cells significantly increased in a dose-dependent manner after exposure to 7.5-30 μg/mL extractable organic matter of PM10 for 1hr. After exposure to extractable organic matter of PM 10 for 1hr, intracellular ROS increased significantly. The 8-OHdG was positive in the HepG2 cells treated with extractable organic matter of PM 10. The protein expression of NF-κB p65 significantly increased in HepG2 cells after treatment with 30 μg/mL extractable organic matter of PM 10 for 24 hr. Conclusion he extractable organic matter of PM 10 induces DNA strand breaks in HepG2 cells. Significant differences in percent of tail DNA relates to PM 10 samples collected at different times and locations. The extractable organic matter of PM 10 exerts DNA damage effects in HepG2 cells probably through oxidative DNA damage induced by intracellular ROS, increase of 8-OHdG formation and the expression of NF-κB p65.
Key words: PM10     HepG2 cells     DNA strand break     oxidative DNA damage    

近年来，中国城乡居民恶性肿瘤死亡率已居世界较高水平，肿瘤发病和死亡构成也在发生变化。肺癌已经代替肝癌成为我国首位恶性肿瘤死亡原因(占全部恶性肿瘤死亡的22.7%)〔1〕。除吸烟，大气污染物是肺癌的另一主要危险因素外，有研究发现，与肺癌发病率相关的大气污染物包括苯并[a]芘、金属、颗粒物质，及颗粒物提取物〔2〕。流行病学研究表明，颗粒物，特别是空气动力学直径≤10 μm的可吸入颗粒物(PM 10)的污染，与人类疾病的发病率、死亡率关系密切，并能促使癌症发生。为了解大气污染与癌症的关系，本研究探讨大气可吸入颗粒物致人肝细胞瘤细胞(HepG2) DNA损伤作用机制。

1 材料与方法 1.1 试剂

低熔点琼脂糖(LMA)及正常熔点琼脂糖(NMA)(北京华美公司)；MEM Eagles with Earle's Balanced Salts (MEM/EBSS)培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；2′，7′-二氢二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)，溴化乙啶(EB)(美国Sigma公司)；抗8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)单克隆抗体(日本NOF公司)；UltraSensitive TM S-P超敏试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)；鼠抗人NF-κB p65单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；鼠抗人β-actin (北京博奥森公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG (北京中杉公司)；细胞核及细胞浆提取试剂盒(南京凯基生物公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

CO2培养箱(美国FORMA公司)；JY2002型电子天平、FA2004型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；JM250型水平式电泳仪，半干式转移电泳槽(大连捷迈公司)；流式细胞仪(日本HITACHI公司)；DY-Ⅲ-5型稳压稳流电泳槽(北京市六一仪器厂)；CK2型倒置显微镜，BX51型荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 空气样品采集及有机物提取

采集PM 10使用TH-150大气采样器(武汉天虹智能仪表厂)，配置TH-PM 10-100型大气颗粒物质切割器，选择大连市区4个不同采样点，于2006年夏季和冬季分别采样，采样流量100 L/min，各点连续采集24 h。将载有样品的石英纤维滤膜剪碎置于具塞闭塞管中，加入15 mL二氯甲烷，超声中提取20 min，倒出并保留二氯甲烷提取液；再加入15 mL丙酮，超声中提取20 min，倒出并保留丙酮提取液；再加入15 mL甲醇，超声中提取20 min，倒出并保留甲醇提取液；合并以上3种提取液，浓缩至挥干，以二甲基亚砜(DMSO)定容至0.6 mL，即得PM 10有机提取物。试验分为7.5，15.0，30.0 μg/mL 3个浓度。

1.4 试验方法 1.4.1 细胞培养

HepG2细胞(中国医学科学院细胞中心)培养于含10%胎牛血清的MEM/EBSS培养基，在37 ℃，5% CO2的培养箱中培养，7 d传代1次，取对数生长期细胞。

1.4.2 SCGE试验

取对数生长期细胞用胰酶消化收获，加入不同地点或不同浓度的PM 10有机提取物，37 ℃悬浮培养1 h，离心弃上清，台盼蓝染色检测细胞存活率为80%以上时用于实验。还采用Hoechst33342染色法在荧光显微镜下检测凋亡细胞。

电泳按文献〔3〕方法稍加改动。在荧光显微镜(激发波长549 nm，发射波长590 nm)下阅片。图像直接输入计算机保存。随机观察50个细胞，利用CASP (Comet Assay Software Project)1.0.1版(University of Wroclaw，Poland)软件测定彗星尾DNA%。彗星样细胞尾DNA%以单位空气量(m3)中PM 10有机提取物所致尾DNA%表示，即尾DNA%/m3。实验重复3次。

1.4.3 活性氧(ROS)的测定

将5×105个细胞悬浮于含不同浓度PM 10有机提取物的无血清培养基中，37 ℃作用1 h。1 000 r/min离心5 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，然后加入终浓度为5 μmol/L的DCFH-DA磷酸盐缓冲液，37 ℃作用30 min后，磷酸盐缓冲液洗涤3次，流式细胞仪测定细胞内二氯荧光素的平均荧光强度。

1.4.4 8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)免疫组化分析

参照文献〔4〕略加改进。细胞在显微镜下阅片，应用Image-pro plus 4.5.1图像分析系统进行定量图像分析，随机观察50个细胞。用测得的吸光度(A)值(数值放大1000倍)表示8-OHdG阳性表达的相对强弱。

1.4.5 NF-κB p65的检测

NF-κB p65的检测采用蛋白印迹法(Western blot)分析，按蛋白提取试剂盒说明书，提取经不同浓度PM 10有机提取物处理的HepG2细胞核蛋白。蛋白于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转膜，加入NF-κBp65鼠抗人单克隆抗体(1:200稀释)4 ℃过夜，加辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗(1:2000稀释)室温摇床孵育2 h，DAB显色3~10 min，扫描，于凝胶自动成像分析系统下成像，测定条带的平均积分吸光度值。以目的蛋白和β-actin条带吸光度比值表示目的蛋白相对含量，对照组的相对表达量为1，实验组的相对表达量用与对照组比较的倍数表示。

1.5 统计分析

采用SPSS 11.5软件进行分析，用单因素方差分析(ANOVA)进行处理，组间均数间多重比较用最小显著差法(LSD)。

2 结果 2.1 PM 10的有机提取物致HepG2细胞DNA链断裂水平(图 1，表 1)
与同监测点夏季比较，a P < 0.05；与金州、周水子及甘井子监测点夏季样品比较，b P < 0.05；与周水子和甘井子监测点夏季样品比较，c P < 0.05；与金州、周水子及甘井子监测点冬季样品比较，d P < 0.05。 图 1 大连市4个监测点PM 10有机提取物致HepG2细胞DNA链断裂水平

表 1 不同浓度PM 10有机提取物对HepG2细胞尾DNA%影响(x±s)

PM 10有机提取物与HepG2细胞接触1 h，台盼兰染色显示各组细胞存活率均在 > 90%；Hochest 33342染色，荧光显微镜下观察，未见凋亡细胞。图 1显示，4个监测点冬季PM 10有机提取物样品致HepG2细胞DNA链断裂作用比夏季更明显，差异有统计学意义(P < 0.05)。无论夏季还是冬季，开发区PM 10有机提取物致HepG2细胞DNA链断裂作用均最严重。

以冬季开发区PM 10有机提取物样品为代表，探讨其致HepG2细胞DNA链断裂作用的剂量依赖关系。各组细胞存活率及凋亡细胞染色结果同上。如表 1所示，尾DNA%随剂量增高而增大，与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.05)，提示PM 10有机提取物致HepG2细胞DNA链断裂作用存在剂量依赖关系。

2.2 PM 10有机提取物对HepG2细胞内ROS水平影响(表 2)
表 2 PM 10有机提取物对HepG2细胞产生ROS的影响(x±s, n=3)

HepG2细胞与PM 10有机提取物接触1 h后，PM 10有机提取物浓度为15.0和30.0 μg/mL时，HepG2细胞内ROS水平明显升高，与对照组及低剂量组比较，差异均有统计学意义(P < 0.05)。

2.3 PM 10有机提取物对HepG2细胞内8-OHdG表达水平影响

经前述免疫组化染色后，在显微镜下观察，8-OHdG阳性物质呈棕黄色，主要集中在细胞核。经定量分析，HepG2细胞核的平均光密度值随着阳性对照物H2O2浓度的增高而明显增加。15.0和30.0 μg/mL的PM 10有机提取物均可引起HepG2细胞核平均吸光度(A)值明显增加(P < 0.05)。

2.4 PM 10有机提取物对HepG2细胞NF-κB p65蛋白表达水平影响(表 3)
表 3 PM 10有机提取物对HepG2细胞中NF2-κB p65蛋白表达水平影响(x±s, n=3)

正常情况下HepG2细胞核内N-κB p65蛋白仅少量表达，PM 10有机提取物与HepG2细胞接触24 h后，核蛋白中的NF-κB p65蛋白随其浓度的增加，表达逐渐增强，与对照组及PM 10有机提取物7.5 μg/mL组比较，30 μg/mL组NF-κB p65蛋白表达水平明显增加，差异有统计学意义(P < 0.05)。各组β-actin蛋白表达差异无统计学意义。

3 讨论

本研究发现，大连市4个监测点PM 10有机提取物可引起HepG2细胞不同程度的DNA链断裂，冬季较夏季更严重，这可能与冬季燃料耗用量大，污染物中多环芳烃的含量高有关〔5〕。不同监测点样品致HepG2细胞DNA链断裂水平也各异。提示PM 10可引起HepG2细胞DNA损伤，表明HepG2细胞DNA链断裂是敏感的生物监测指标。

大气颗粒物致健康损伤的机制迄今尚不清楚，但已有研究数据支持氧化性损伤可能是其重要机制。研究表明〔6〕，PM 10具有自由基活性，这些自由基引起的氧化性损伤可能是大气颗粒物导致机体损伤的初始原因。本研究发现，PM 10有机提取物可导致剂量依赖的HepG2细胞内ROS生成，并使NF-κB活化，从而启动靶基因的转录，促进一些炎症介质的转录表达，加重细胞的损伤。HepG2细胞8-OHdG过表达，表明鸟嘌呤8位碳原子被氧化，从而形成氧化性加合物8-OHdG。Shi T等〔7〕发现，大气颗粒物可使肺泡细胞产生羟基自由基(·OH)，并诱发8-OHdG的形成。本研究结果提示，PM 10有机提取物引起氧化性DNA损伤可能是其遗传毒性和致癌性的作用机制之一。

参考文献
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