基于酵母细胞的抗朊病毒药物筛选平台揭示了菲啶等芳香性生物碱具有抗朊病毒作用^〔1-2〕，但是生物碱通常存在一定的遗传毒性^〔3〕。该毒性会导致药物筛选时产生抑制细胞生长、致突变作用，严重地影响抗朊病毒药物筛选效果。中药炮制是我国传统的制药技术，在增强药效、改变药性和降低毒性方面起重要作用^〔4〕。因此，本研究以遗传毒性明显的草乌为样本，通过Ames试验和彗星试验检测草乌炮制前后的遗传毒性，并对该炮制方法的减毒效果进行评估。

草乌(辽宁中医药大学馈赠)。二甲基亚砜(DMSO)，敌克松(Dexon)，二氨基芴(2-AF)，甲基磺酸甲酯(MMS)，TritonX-100，溴化乙锭(EB)(美国Sigma公司)。

实验菌株为组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌TA97、TA98、TA 100和TA102菌株(沈阳国家新药安全评价中心遗传毒理实验室)经鉴定各项遗传特性均符合实验要求，菌株增菌、基因型鉴定及试验用培养基均按文献〔5〕操作。

雄性昆明种小鼠(中国医科大学实验动物中心)，体重25 g左右，常规喂养，观察1周后，健康者供试验用。

取草乌生药50 g清蒸，加热蒸透6 h，取出，置于室温自然干燥。将生草乌及炮制后的草乌进行粉碎，粉碎后的中药按1:10料液比加入蒸馏水，置于80 ℃水浴中温浸提取3次，每次3 h。过滤，合并滤液，55 ℃旋转蒸发得浓缩样品，冷冻干燥后备用。

采用标准平皿掺入法^〔5〕，依照文献〔6〕方法。受试物生草乌和清蒸草乌最终浓度分别为5 000，1 667，556，185 μg/皿，代谢活化组设阳性对照2-AF 20 μg/皿，TA100非代谢活化时阳性对照NaN₃ 50 μg/皿，其他菌株非代谢活化时阳性对照Dexon 50 μg/皿，阴性对照DMSO 0.1 mL/皿。

小鼠颈脱臼处死后，制备小鼠股骨骨髓细胞悬液，D-Hanks液调整细胞浓度为10⁶~10⁷个/mL，4 ℃冷却待用。将制得的细胞分装于8个5 mL离心管中，用RPMI1640培养液将体积加至2.5 mL，每管中加入受试物、阳性药甲基磺酸甲酯(MMS)，终浓度为100 μg/mL，使生草乌及清蒸草乌的最终浓度为1.25，2.5，5.0 mg/mL，另设双蒸水作为阴性对照，混匀后置于37 ℃恒温水浴中染毒1.5 h。染毒结束后1 000 r/min离心5 min，去上清液，以100 μL冰冷的D-Hanks液重悬细胞，台盼兰染色测定细胞存活率。

彗星试验按照文献〔6〕方法。荧光显微镜下用515~560 nm的激发光观察，在200×下每处理组计数100个彗星图像，用CASP (Comet Assay Software Project)图像分析软件测定尾长、尾部DNA含量。

应用SPSS 11.5软件进行统计分析。

表 1

表 1 生草乌及清蒸草乌鼠伤寒沙门氏菌体外回复突变试验结果(x±s)

表 1 生草乌及清蒸草乌鼠伤寒沙门氏菌体外回复突变试验结果(x±s)

从表 1可见，生草乌Ames试验，TA97、TA100、TA102菌株无论代谢活化或非代谢活化，皆为阳性，表明生草乌具有诱导微生物基因突变的能力。清蒸草乌Ames试验，只有TA102菌株在5 000μg/皿剂量组，无论代谢活化或非代谢活化细菌回变数大于阴性对照组细菌回变数的2倍，即清蒸草乌Ames试验，TA97、TA98、TA100、TA102菌株无论代谢活化或非代谢活化，皆为阴性，表明清蒸草乌不具有诱导微生物基因突变的能力。

表 2

表 2 生草乌及清蒸草乌对小鼠骨髓细胞DNA损伤(x±s)

表 2 生草乌及清蒸草乌对小鼠骨髓细胞DNA损伤(x±s)

从表 2可见，1.25，2.5，5.0 mg/mL剂量组的生草乌与阴性对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)，随着剂量的增加，存在着明显的剂量-效应关系，可引起DNA损伤。清蒸草乌各剂量组随着受试物浓度的升高，细胞受损度增高，但无明显的阳性反应，与阴性对照组比较差异无统计学意义(P > 0.05)，得出该受试物在试验剂量范围内不能引起小鼠骨髓细胞的DNA损伤。使用台盼兰进行细胞存活率测定时，试验前细胞存活率均在95%以上，染毒后的细胞存活率也在90%以上，表明DNA损伤为受试物作用所致，而非细胞毒性。

本研究结果表明，草乌清蒸炮制后遗传毒性明显减小。草乌中的有效成分乌头碱为酯类化合物，加热后水解失去一分子乙酸，进一步水解失去一分子苯甲酸生成乌头胺，其毒性明显降低^〔8〕。研究证明，乌头胺的临床疗效与乌头碱相似。因此，该炮制具有药物筛选意义以及临床意义。

在Ames试验中，设立了+S9代谢活化组和-S9非代谢活化组。2组试验结果显示，在检测清蒸草乌和生草乌遗传毒性时有较好的一致性，为口服型抗朊病毒中药的筛选和开发提供了一定的实验基础。

本结果对在利用酵母细胞筛选抗朊病毒药物的实验中，通过炮制来降低和排除由于中药毒性或遗传毒性所造成的干扰，在更大的范围内筛选抗朊病毒生物碱类中药的研究有一定的指导意义。乌头碱只是生物碱的一种，它具有代表性，但不具有普遍性；另外，草乌最佳炮制工艺以及确切的减毒机制还有待进一步研究。因此，还需要对更多有遗传毒性的生物碱进行深入研究，为抗朊病毒中药的筛选奠定有力实验基础。