有报道, 亚洲牛带绦虫Spef1-like基因是一种保守的睾丸特异蛋白, 广泛的存在于脊椎和无脊椎动物中, 是比较保守的蛋白, 其功能主要是与精子的发生有关^〔1-3〕。本研究通过对此基因进行克隆表达, 最终得到高纯度的功能蛋白, 为研究其生物学功能及分类提供基础依据。

虫体标本采自亚洲牛带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡, 亚洲牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建、EST测序及Unigene分析由上海联合基因有限公司合作完成。大肠埃希菌BL-21/DE3及原核表达质粒pET-28a (+)为中山大学热带病重点实验室保存。

胰蛋白胨、酵母提取物(英国OXOID公司); 限制性内切酶: EcoR Ⅰ、XhoⅠ; Taq酶、dNTP、Extra Taq^TM酶、RNase、T4 DNA连接酶、DNA2000 Marker (大连宝生物公司); 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) (美国Promega公司); Ni-IDA Agarose (catNo.69670) (美国Novagen公司); 十二烷基磺酸钠(SDS) (美国Sigma公司); 蛋白分子量标准(立陶宛MBI公司); PVDF膜(美国Millipore公司); 质粒提取试剂盒(广东东盛生物科技有限公司); DNA凝胶回收试剂盒(广州波尔生物科技公司); 辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗, 兔抗人IgG二抗, DAB (3, 3二氨基联苯胺)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司); 丙烯酰胺、尿素(上海荣仲实业有限公司); 氯化钙、氯化钠为国产分析纯试剂。

基因扩增引物由Introvigen上海生物技术有限公司合成, 重组质粒DNA的测序由北京华大基因科技股份有限公司完成。

亚洲牛带绦虫成虫cDNA质粒文库由本课题组构建^〔3〕。将获得的亚洲牛带绦虫unigene进行Blastx分析, 获得编码亚洲牛带绦虫APG3基因的克隆号为TaHC22-a7。

根据已获得的Spef1-Like全长编码序列的开放阅读框, 利用DNAClub和PCRdesign软件设计引物:上游引物: 5′-ACCGGATCCATGAATAATAGTACCAAC-3′带ECOR1酶切位点; 下游引物: 5′-AATCTCGAGTTACGTCACTGAAAAGT-3′带XhoⅠ酶切位点(引物由上海英骏生物技术公司合成)。以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中编号为Ta hc22-a7的质粒为模板, 应用上述设计的特异引物, TaKaRa Ex Taq^TM酶进行聚合酶链反应(polymerase chain reactiom, PCR)扩增目的基因。反应总体积50 μL且PCR反应循环参数为:预变性94 ℃, 5 min; 变性94 ℃, 1 min; 退火58 ℃, 1 min; 延伸72 ℃, 1 min; 30个循环后72 ℃总延伸10 min。PCR产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定回收。

将PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切, 原核表达质粒pET-28a (+)也用ECOR1和XhoⅠ进行双酶切, 回收酶切产物, 在T4 DNA连接酶作用下, 16 ℃连接过夜, 然后将连接产物转化到大肠埃希菌BL-21/DE3感受态细胞中, 涂布于含卡那的LB平板, 37 ℃温箱倒置培养12~16 h, 挑取卡拉霉素LB固体培养基上的阳性单克隆, 提取质粒进行双酶切、PCR和DNA测序鉴定。

将确定能表达重组蛋白的单菌落接入含有5 μL卡拉霉素的LB液体培养基中(菌液/培养基=1: 100), 37 ℃摇至A600约为0.4~0.6, 加入IPTG至终浓度为1 mmol/L, 37 ℃, 280 r/min, 摇床诱导表达5 h后离心收集菌体, 用SDS-PAGE检测蛋白质的表达。同时设pET-28a (+)质粒的诱导前后及重组质粒的诱导前作对照。

依据上述诱导表达方法对阳性克隆进行大量的诱导表达。大量诱导表达后的产物经4 ℃, 8000 r/min离心, 20 min后, 用基础液重悬沉淀, 反复3次冻融, 并冰上放置超声裂解细菌, 收集上清和沉淀, 分别取上清和沉淀加入上样缓冲液, 煮沸5~10 min后进行SDS-PAGE判断重组蛋白的可溶性。结果发现, 该蛋白在上清表达。因此, 将收集好的上清参照Ni-IDA Agarose说明书进行蛋白纯化, 将洗脱的目的蛋白在0.15 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)透析液中4 ℃透析24 h。

Blastx结果显示, 在已构建的亚洲牛带绦虫cDNA质粒文库中存在完整的Spef1-Like基因序列, 该基因在GenBank中与曼氏血吸虫(登录号AAX56301.1) Spef1-Like基因同源性最高, 其一致性达43%, 相似性达60%。蛋白含有一个motif, 功能不明确, 但提示可能为一种与钙结合蛋白同源的模序结构。

图 1

注: 1: DNA标准(DL2000); 2: Spef1-Like的PCR产物; 3: pET-28a (+)-Ta Spef1-Like的双酶切; 4, 5: pET-28a (+)-Ta Spef1-Like重组质粒; 6: DNA标准(DL 15 000)。 图 1 重组质粒的PCR及双酶切鉴定

将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定, 产物行10 g/L琼脂糖凝胶鉴定。第2泳道为PCR结果, 出现清晰条带位置大约在750~1 000 bp, 与目的基因的大小基本相符; 第3泳道为双酶切结果, 可以看到质粒被切成2个条带, 下边条带位置与目的基因基本相符。以上均证明重组质粒构建成功。

图 2

注: 1:蛋白标准; 2: pET-28a (+)质粒未加IPTG诱导; 3: pET-28a (+)质粒加IPTG诱导; 4: pET-28a (+)-Ta Spef1-Like重组质粒未加IPTG诱导; 5: pET-28a (+)-Ta Spef1-Like重组质粒加IPTG诱导; 6: pET-28a (+)-Ta Spef1-Like重组质粒上清; 7: pET-28a (+)-Ta Spef1-Like重组质粒纯化蛋白。 图 2 10%SDS-PAGE分析pET-28a (+)-Ta Spef1-Like在大肠埃希菌中的表达产物及其纯化产物

将构建好的重组质粒转化到E. coli BL/DE3中, 超声裂解后的上清和沉淀用SDS-PAGE鉴定其可溶性, 发现蛋白表达在上清(第6泳道)。将蛋白上清进行纯化, 结果第7泳道条带位置与目的蛋白相符, 证明蛋白纯化成功。

经NCBI网站Blastx在线分析, 所获基因的氨基酸序列与GenBank中曼氏血吸虫的Spef1-like基因最接近, 推测为亚洲带绦虫Spef1-like基因, 并且含有完整的开放阅读框, 是一个全长cDNA序列。其一级结构发现, 该蛋白含有一个motif, 功能不明确, 但提示可能为一种与钙结合蛋白同源的模序结构^〔4〕。

本研究已经成功构建了亚洲带绦虫Spef1-like原核表达载体, 并获得了高效表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明, 该蛋白在上清中有表达, 取上清过His的镍离子亲和层析柱(参照Ni-NTA Agarose说明书进行)后, 得到了大量较纯的重组蛋白。由于该蛋白广泛的存在于脊椎动物和无脊椎动物中^〔5〕, 其功能还未被完全的挖掘, 特别是在带绦虫的研究中还是一个空白。因此, 未来的工作可以将该蛋白进行定位和做一些免疫方面的实验, 使其除了为研究亚洲牛带绦虫进化提供信息外, 还可深入地研究其在亚洲牛带绦虫繁殖中的作用^〔6〕, 以及在此基础上判断其能否作为亚洲牛带绦虫病疫苗和药物靶标, 从而提高亚洲牛带绦虫病的综合防治水平。