黄病毒属是一群具有包膜的单正链RNA病毒, 其中蚊传黄病毒可引起登革热、日本脑炎和黄热病等。近年来, 随着全球气候变暖以及缺乏对病媒的有效控制措施等造成黄病毒感染有扩大趋势^〔1-2〕。目前中国已发现的黄病毒有日本脑炎病毒^〔3〕、森林脑炎病毒^〔4〕和登革病毒^〔5〕。为加强虫媒传播疾病的预防与控制, 辽宁省自2005年起重点进行虫媒带毒情况监测。2008年8月, 在辽宁省朝阳市农村畜舍蚊虫带毒监测中, 从蚊体中分离到一种新的病毒, 经对该病毒进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测和编码区全基因测序鉴定分析, 证明该病毒属于蚊传黄病毒中的一个新的种群。经GenBank分析确认应属于世界首次发现, 根据蚊虫采集地点将这株新的病毒命名为朝阳病毒(Chaoyang virus, CV)^〔6〕, 收录号为FJ883471。现将鉴定结果报告如下。

(1)标本采集:2008年8月在朝阳市农村畜舍, 采用诱蚊灯于19:00~21:00采集蚊虫, 采集分类后每50只为1批, 装入冻存管于液氮罐中冻存。(2)细胞及试剂:白纹伊蚊C6/C36细胞(本实验室保存); RNA提取试剂盒(Rneasy mini kit)和胶回收试剂盒(Quick GelExtration Kit)(美国Qiagen公司); PCR产物克隆用载体pMD19-T、JM109感受态细胞、RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司); 其他试剂均为分析纯试剂。(3)黄病毒属参考毒株:所用36株黄病毒全基因序列全部来自GenBank^〔7〕, 分别为Apoi virus (APOIV, NC_003676);Alkhurma virus (AV, NC_004355);Bagaza virus (BAGV, NC_012534);Cell fusing agent virus (CFAV, NC_001564);Dengue virus 1 (DENV-1, NC_001477);Dengue virus 2(DENV-2, NC_001474); Dengue virus 3(DENV-3, NC_001475); Dengue virus 4(DENV-4, NC_002640);Entebbe bat virus (ENTV, NC_008718);Gadgets Gully virus (GGYV, DQ23515);Ilheus virus (ILHV, NC_009028);Japanese encephalitis virus (JEV, NC_001437); Kadam virus (KADV, DQ235146);Kedougou virus (KEDV, NC_012533);Kokobera virus (KOKV, NC_009029);Karshi virus (KSIV, NC_006947);Langat virus (LGTV, NC_003690);Louping ill virus (LIV, NC_001809);Meaban virus (MEAV, DQ235144); Montana myotis leukoencephalitis virus (MMLV, NC_004119);Modoc virus (MODV, NC_003635);Murray Valley encephalitis virus (MVEV, NC_000943);Omsk hemorrhagic fever virus (OHFV, NC_005062);Powassan virus (POWV, NC_003687);Rio Bravo virus (RBV, NC_003675);Sepik virus (SEPV, NC_008719);St.Louis encephalitis virus (SLEV, NC_007580);Saumarez Reef virus (SREV, DQ235150);Tick-borne encephalitis virus (TBEV, NC_001672);Tyuleniy virus (TYUV, DQ235148);Usutu virus (USUV, NC_006551);West Nile virus (WNV, NC_001563);West Nile virus NY99 (WNVNY99, NC_009942);Yellow fever virus (YFV, NC_002031);Yokose virus (YOKV, NC_005039);Zika virus (ZIKV, NC_012532)。(4)引物:黄病毒属通用引物参照文献〔8〕合成, 碱基序列如下:FG1:5'TCAAGGAACTCCACACATGAGATGTACT 3';FG2:5'GTGTCCCATCCTGCTGTGTCATCAGCATACA3';理论扩增片段长度958 bp。全基因测序所用10对引物通过用Primer Premier 5.0软件自行设计; 由北京三博远志生物技术有限责任公司进行引物合成。

从液氮罐中取出冻存管, 将蚊虫样本迅速倒人研磨器中, 加入Eangle's液1 mL清洗, 吸出液体后再加人1 mL Eangle's研磨液, 反复研磨至组织碎片基本消失为止。将研磨液吸入离心管, 4℃, 12 000 r/min离心20 min。取0.1 mL上清液接种C6/C36细胞, 置28℃、5%CO₂培养箱, 1 h后弃去接种液体, 加入7 mL细胞维持液(血清含量为2%), 细胞置于28℃、5% CO₂培养箱中继续培养, 逐日观察细胞病变; 在C6/C36细胞中连续盲传3代, 弃去无病变者, 将发生病变者连续传代, 使之出现规律病变。按RNA提取试剂盒操作说明, 从病变细胞维持液中提取病毒RNA; 提取纯化后的RNA保存在-80℃冰箱中备用。

以提取的病毒RNA为模板, 以FG2为下游引物在逆转录酶的作用下逆转录获得病毒cDNA, 反应条件为42℃逆转录60 min, 95℃变性10 min, 然后以病毒cDNA为模板进行PCR。PCR反应条件:95℃预变性3 min, 94℃变性1 min, 55℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 35个循环, 72℃延伸10 min。PCR结束后, 扩增的特异性片段经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。以扩增获得预计大小的片段为阳性判定标准; 阳性RT-PCR产物采用胶回收试剂盒回收后, 与质粒pMDl9-T载体连接, 然后转化大肠埃希菌JM109感受态细胞, 通过蓝白斑筛选与菌落PCR鉴定, 阳性克隆送北京三博远志生物技术有限责任公司测序, 测序结果在GenBank中用Blastn进行比较分析。

以提取的病毒RNA为模板, 分别用10对引物进行RT-PCR。阳性扩增产物用胶回收试剂盒回收后, 与质粒pMD19-T载体连接, 然后转化大肠埃希菌JM109感受态细胞, 通过蓝白斑筛选与菌落PCR鉴定, 阳性克隆送北京三博远志生物技术有限责任公司测序。测序结果经拼接后获得病毒编码区全基因核苷酸碱基序列, 用DNAStar软件对分离株与36株黄病毒参考株序列的E基因、NS3基因和NS5基因核苷酸碱基序列进行一致性比较分析; 碱基配对用CLUSTALX软件, 采用Mega 3.1软件邻位相连法(Neighbor-joining)以Cell fusing agent virus (CFAV)为外群(outgroup), 构建黄病毒属编码区全基因遗传进化树, 确信限度估计设为1000。

图 1

图 1 感染及未感染的C6/C36细胞(100×)

蚊虫样本研磨液接种C6/C36细胞后, 于96 h时出现细胞病变, 共有2批细胞出现规律性病变。病变表现为细胞变形, 排列紊乱, 细胞间隙扩大; 144 h时病变达到高峰, 表现为细胞圆缩、聚集和脱落; 病变细胞全部来自刺扰伊蚊样本。

图 2

注:M:DNA Marker; 1, 2:病毒分离株。 图 2 PCR扩增产物的电泳图谱

从2批病变细胞中提取病毒RNA, 用黄病毒属通用引物进行RT-PCR扩增。结果显示, 扩增片段大小均在近1 000 bp处, 与理论值相仿; 扩增片段克隆测序后实际扩增长度为986 bp。扣除引物序列, 对2株病毒序列进行分析。结果显示, 2株病毒的核苷酸碱基序列100%一致, 为同一种病毒。在GenBank中用Blastn进行比较分析, 未发现有高度相似序列, 但有大约600~750 bp序列与登革病毒2型(Dengue virus 2)、伊桂普病毒(Iguape virus)、塞皮克病毒(Sepik virus)和班奇病毒(Banzi virus)有66%~68%的一致性, 表明2株病毒可能是黄病毒属的一个新种。

图 3

图 3 黄病毒属编码区全基因核苷酸序列系统发生树分析

对其中1株病毒进行编码区全基因测序, 测序结果拼接后, 获得编码区全基因核苷酸碱基序列, 编码区只含有一个开放阅读框架(ORF), 全长10 308 bp, 负责编码C、PrM、E、NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。一致性比较分析结果显示, E基因核苷酸碱基序列与日本脑炎病毒群中圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus)一致性最高, 为59.6%; NS3基因核苷酸碱基序列与登革病毒群中科都病毒(Kedougou virus)一致性最高, 为61.7%;NS5基因核苷酸碱基序列与黄热病毒群中塞皮克病毒一致性最高, 为67.0%。黄病毒属编码区全基因遗传进化树分析结果可见, 在36株黄病毒参考株中, 朝阳分离株与登革病毒群、日本脑炎病毒群、可可贝拉病毒群、恩塔亚病毒群、斯庞德温尼病毒群亲缘关系较近, 在同一大进化簇内, 拥有共同的进化祖先, 表明朝阳分离株属于蚊传黄病毒; 但在这一进化簇内, 朝阳分离株又拥有单独的进化分支, 构成一新的种群。

根据上述结果, 本次在辽宁省朝阳市乡镇畜舍分离到的病毒株应为黄病毒属中的蚊传黄病毒, 但不属于任何现已发现的种群, 应是黄病毒属的一个新种。因此, 按照蚊虫采集地点将其命名为朝阳病毒(Chaoyang virus, CV), 并将此序列上传至GenBank中, 收录号为FJ883471^〔9〕。

本次分离到的病毒株其E基因、NS3基因与NS5基因碱基序列与其他黄病毒相比较, 碱基序列一致性最高分别才达到59.6%, 61.7%和67.0%, 表明分离株是黄病毒但却不属于黄病毒属中任何一个种群。编码区全基因遗传进化树分析结果显示, 分离株与登革病毒群、日本脑炎病毒群、可可贝拉病毒群、恩塔亚病毒群、斯庞德温尼病毒群拥有共同的进化祖先, 证明其属于蚊传黄病毒。在系统发生上分离株处在单独的进化分支上, 结合碱基序列一致性分析结果, 判定本次从辽宁省朝阳市乡镇畜舍蚊体中分离到的蚊传病毒是首次发现的一种新的黄病毒, 构成黄病毒属一个新的种群并命名为朝阳病毒(Chaoyang virus, CV)。

朝阳病毒与引起发热、出血、休克的登革病毒和引起脑炎的乙脑病毒及圣路易斯脑炎病毒之间进化关系密切。因此, 朝阳病毒能否感染人、能否致病是进一步研究的重点。

本次发现的朝阳病毒分离宿主刺扰伊蚊, 适应性极强, 幼虫广泛孳生于土坑、浅潭、池塘、洼地积水、沼泽、稻田等; 其雌蚊主要刺叮牛、马等家畜, 同时也兼吸人血^〔10〕。刺扰伊蚊分布极广, 中国各省均有分布, 也是辽宁省各地优势蚊种之一。因此, 今后应加强对刺扰伊蚊的监测力度, 重点加强蚊虫密度、密度指数、带毒情况以及带毒率的监测工作。