2009, Vol. 25
2. 中国医科大学附属第四医院
文献研究显示，20%~30%的大肠癌患者根治术后5年内死于肿瘤局部复发或远处转移，但其区域淋巴结常规组织学检查诊断多为阴性，原因主要是患者血循环和局部淋巴结中存在有常规检查无法发现的微转移肿瘤细胞〔1, 2〕。因此，需要可靠且灵敏度高的检测方法，准确地对大肠癌患者进行临床分期、评估预后及制定有效的辅助治疗方案。为探讨检测大肠癌患者外周血及淋巴结中癌胚抗原信使核糖核酸(CEA mRNA)的表达，为大肠癌患者的术前诊断及分期提供依据，本研究应用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参因子，对2005年9月~2006年4月在辽宁省肿瘤医院40例大肠癌手术患者进行了观察。结果报告如下。
1 对象与方法 1.1 对象选取2005年9月~2006年4月大肠癌手术患者40例。肠癌分期标准参照2003年国际抗癌联盟和美国肿瘤联合会联合制定的改良版Dukes分期法〔3〕。其中，A期：肿瘤限于肠壁内，4例; B期：肿瘤已侵及肠壁外，18例; C期：伴有淋巴结转移，14例; D期：有远处转移，1例。正常对照组随机选取辽宁省肿瘤医院职工健康体检者，男女性各5人，年龄20~50岁。
1.2 方法 1.2.1 试剂与仪器血液RNA提取试剂(RNAout和RNALOCKER，天泽基因工程有限公司); 总RNA分离试剂盒(RNeasy Mini Kit，德国Qiagen公司); RG3000荧光定量PCR仪(澳大利亚Corbett Research公司); ExScript RT-PCR Kit (宝生物工程(大连)有限公司)。
1.2.2 样本前处理(1) 样品收集：大肠癌患者40例术前各采集2 mL外周血，乙二铵四乙酸二钠盐(EDTA) K2抗凝。术中34例取淋巴结，置于1 mL RNALOCKER中保存备用。(2) 外周血与淋巴结总RNA提取：外周血按RNAOUT试剂盒说明提取总RNA; 取30 mg淋巴结，用RNeasy Mini Kit按试剂盒说明提取总RNA。(3) cDNA合成：取5μl总RNA，按ExScript RT-PCR Kit说明，在20 μl体系中进行逆转录。
1.2.3 癌胚抗原信使核糖核酸(CEA mRNA)检测(1) 癌胚抗原(CEA)引物：F-P:5′-GGCACCTCAGACCAATCATCAA-3′, 产物长度107 bp, 温度(Tm)64.52 ℃; R-P:5′-ACCTTAGCAGAGGCCAAGGTTTC-3′, 温度(Tm)64.11 ℃。(2) 三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物碱基序列:引物F-P：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′, 254 bp，温度(Tm)59.8 ℃; R-P：5′-GGATCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3′, 温度(Tm)64.2 ℃。引物由宝生物工程(大连)有限公司设计合成。反应条件:预变性95 ℃ 10 s，然后95 ℃ 5 s, 60 ℃ 20 s, 40个循环，融解曲线分析60~95 ℃。(2)实时荧光定量PCR:采用实时荧光定量PCR进行CEA mRNA表达量测定，以GAPDH作为内参照; 使用SYBR GreenⅠ进行荧光标记。20 μl反应体系包括SYBR Premix 10μl, 引物F-P 0.4 μl, 引物R-P 0.4 μl, 灭菌蒸馏水(RNase free)8.2 μl，cDNA 1μl。结果用Comparative Delta-delta Ct法〔4〕进行分析，比较目的基因的相对表达量。
1.3 统计分析采用χ2检验进行统计分析, P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 标准曲线将质粒标准进行梯度稀释后，对样品中的目的基因CEA mRNA和看家基因GAPDH mRNA分别做标准曲线。结果显示，2组标准曲线的斜率(M值)分别为-2.963和-3.008，2者差值 < 0.1, 表明可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量。
2.2 患者与对照组外周血CEA mRNA表达差异40例大肠癌患者中，外周血CEA mRNA呈阳性表达者35例，占87.5%，正常对照10人均未检出CEA mRNA阳性表达，2组比较差异有统计学意义(χ2=25.15，P < 0.01)。
2.3 不同大肠癌临床分期CEA mRNA表达差异(表 1)
|
表 1 大肠癌患者不同临床分期CEAmRNA表达差异比较 |
40例大肠癌患者，按临床分期分为A+B、C+D 2组，比较2组CEA mRNA表达差异。表 1可见，临床分期与淋巴结CEA mRNA阳性表达呈密切相关性，差异有统计学意义(χ2=5.4，P < 0.05)。C+D期大肠癌患者外周血中CEAmRNA阳性率较A + B期为高, 但差异无统计学意义(χ2=0.75, P > 0.05)。
3 讨论研究表明, 大肠癌根治术后复发和转移率高达30%~40%左右〔5〕; 结肠癌患者外周血CEA mRNA的表达高于健康人、结肠良性肿瘤以及其他实体肿瘤，并且其表达与Dukes分期和是否有淋巴结相关〔6〕; 因此, CEA mRNA表达的检测对判断大肠癌的复发，转移及指导临床治疗有重要价值。Ueno等〔7〕检测胃癌患者外周血CEA mRNA，发现其表达与胃癌侵犯深度、淋巴结转移、组织学分级、脉管侵犯和术后生存率密切相关。按国际肿瘤分期标准(TNM)分期越晚，癌细胞脱落到血液中的可能性越大，全身转移的可能性就越大，患者的预后就越差〔7, 8〕。本研究结果显示，40例大肠癌患者手术前外周血CEA mRNA表达阳性率为87.5%，而正常健康组10人无1人阳性，差异有统计学意义，可以排除假阳性可能，提示该方法特异性较高。C+D期大肠癌患者外周血中CEA mRNA阳性率高于A+B期，虽然差异无统计学意义，但提示外周血中已有肿瘤细胞存在，在诊断恶性肿瘤方面可能具有较好的临床应用价值。因此, 检测大肠癌患者外周血中CEA mRNA的相对表达量有助于大肠癌患者的术前辅助诊断。在临床分期C+D期淋巴结中CEA mRNA阳性率(53.3%)明显高于A+B期(15.8%)，差异有统计学意义，表明Dukes C、D期大肠癌的病情程度和预后不良，提示检测淋巴结中CEA mRNA的相对表达量则有助于大肠癌患者的临床分期。
| [1] | 刘连杰, 叶芳耘. 基因检测大肠癌区域淋巴结微转移的研究[J]. 中国实用外科杂志, 2000, 20(11) : 664–665. |
| [2] | 龚丽明, 程若川, 李恩全. 大肠癌微转移检测的现状及展望[J]. 大肠肛门病外科杂志, 2003, 9(2) : 137–138. |
| [3] | 卿三华. 结直肠癌临床病理分期系统及其临床意义[J]. 世界华人消化杂志, 2003, 11(11) : 1760–1763. |
| [4] | Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C (T)) Method[J]. Methods, 2001, 25(4) : 402–408. DOI:10.1006/meth.2001.1262 |
| [5] | Linuma H, Okinaga K, Egami H, et al. Usefulness and clinical significance of quantitative real-time RT-PCR to detect isolated tumor cells in the peripheral blood and tumor drainage blood of patients with colorectal cancer[J]. International Journal of Oncology, 2006, 28 : 297–306. |
| [6] | Shen C, Hu L, Xia L, et al. Quantitative real-time RT-PCR detection for survivin, CK20 and CEA in peripheral blood of colo-rectal cancer patients[J]. Jpn J Clin Oncol, 2008, 38(11) : 770–776. DOI:10.1093/jjco/hyn105 |
| [7] | Ueno H, Yoshida K, Hirai T. Quantitative detection of carcinoembryonic antigen messenger RNA in the peritoneal cavity of gastric cancer patients by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction[J]. Anticancer Res, 2003, 23(2C) : 1701–1708. |
| [8] | 黄甜, 聂绍发, 柳巍, 等. 大肠癌患者生存时间影响因素分析[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(1) : 73–74. |