过氧化氢(H₂O₂)是一种重要的氧自由基(ROS)，可导致包括心肌细胞在内的多种细胞发生一系列生化反应。在代偿范围内，ROS对心肌造成的损伤是可以恢复的，而超过一定限度，将造成包括心肌细胞坏死和凋亡在内的不可逆损伤^〔1〕。动物实验及临床观察均可见到缺血再灌注损伤中有心肌细胞凋亡发生，并伴有过量的ROS产生^〔2〕。因此，研究H₂O₂造成心肌损伤的机制可为临床治疗有关疾病提供新的思路和方法。

(1)主要仪器与试剂：荧光显微镜(日本Olympus公司)；FACScan流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；细胞培养箱(日本Espc311A公司)。H₂O₂(北京化工厂)；新生牛血清(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国DIFCO公司)；二甲基亚砜(DMSO，德国Merck公司)；Dulberco Modified Eagles Mediu (DMEM培养基，美国Gibco公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)。(2)细胞：H9c2大鼠心肌细胞(北京大学医学部公共卫生学院李勇教授惠赠)。

H9c2细胞置于10%新生牛血清的高糖DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO₂条件下传代培养。取对数生长期、生长良好的细胞进行实验。

将细胞接种于96孔培养板，随机分为阴性对照(NC)组和50，100，200.400 μmol/L H₂O₂处理组。各组分别作用1，3，6，12，24 h，然后采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞吸光度(A₄₉₀nm)值^〔3〕。

将细胞接种于24孔培养板内，随机分为NC组，50，100，200，400 μmol/L H₂O₂处理组，分别作用1，3，6，12 h，然后采用丫啶橙/溴乙锭(AO/EB)染色法检测^〔4〕。在倒置荧光显微镜下拍照，计数200个细胞来计算凋亡率。

将细胞接种于24孔培养板内，分为NC组，50，100，200，400 μmol/L H₂O₂处理组，作用6 h后，采用单细胞凝胶电泳(SCGE)检测^〔5〕。在荧光显微镜下，随机计数100个细胞，观察彗星样细胞拖尾情况，并根据拖尾中DNA含量占细胞总DNA的比例将细胞DNA损伤程度分为5级。分级标准：0级， < 5%，无损伤，细胞无拖尾；1级，5%~20%，低度损伤，有少量拖尾；2级，20%~40%，中度损伤，出现明显拖尾；3级，40%~95%，高度损伤，出现严重拖尾；4级，>95%，重度损伤，成为片段。

应用SPSS 13.0软件进行χ²检验。

表 1

表 1 H2O2对H9c2心肌细胞损伤影响(x±s)

表 1 H2O2对H9c2心肌细胞损伤影响(x±s)

不同浓度H₂O₂对H9c2心肌细胞作用后，各剂量组A₄₉₀值有下降趋势。其中50 μmol/L H₂O₂组作用6，24 h后测定的A₄₉₀值与作用相同时间的NC组比较，差异有统计学意义(P < 0.05)：作用1，3，12 h后的测定值与作用相同时间的NC组比较，差异无统计学意义；100，200，400 μmol/L组与对应NC组比较，差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。说明H₂O₂对H9c2心肌细胞具有损伤作用，且随着H₂O₂作用时间的增加，A₄₉₀nm值逐渐降低。其中24 h，400 μmol/L剂量组的A₄₉₀nm值最低。

表 2

表 2 H2O2对H9c2心肌细胞凋亡率影响

表 2 H2O2对H9c2心肌细胞凋亡率影响

在AO/EB双染中，荧光下AO呈绿色荧光，EB呈红色荧光。AO能进入胞膜完整的细胞与DNA结合发出绿色荧光，而EB只能渗入胞膜受损的细胞，与DNA结合发出橙红色荧光。荧光镜下可见：正常细胞细胞核发绿色荧光，密度不均，呈现结构样特征。早期凋亡细胞，核发出明亮的绿色荧光，浓聚成新月形或颗粒状，位于细胞的一侧，可出现一至数个大小不等的斑块状或圆珠状小体。晚期凋亡细胞，细胞同时也被EB染色，核形态与凋亡一致，但呈橙黄色或橙红色荧光。坏死细胞无凋亡小体，核染色不均，呈橙红色荧光，轮廓不清，已解体或接近解体。H₂O₂各剂量组细胞凋亡率与NC组比较，差异均有统计学意义(P < 0.01)。作用1，3h的H₂O₂组均随H₂O₂浓度增大，细胞凋亡率增大；至作用6 h，100 μmol/L剂量组时细胞凋亡率最高，达到22.2%，以后作用时间相同随H₂O₂浓度增大，细胞凋亡率下降；作用12 h的H₂O₂组随H₂O₂浓度增大细胞凋亡率也增大，到100 μmol/L时细胞凋亡率最高，达到19.8%，以后随H₂O₂浓度增大细胞凋亡率反而下降。

表 3

表 3 H2O2对H9c2心肌细胞DNA损伤影响

表 3 H2O2对H9c2心肌细胞DNA损伤影响

50，100，200，400 μmol/L H₂O₂剂量组均可致心肌细胞DNA损伤，且损伤率均明显高于NC组，差异均有统计学意义(P < 0.01)。

本实验结果表明，不同浓度的H₂O₂可以决定心肌细胞的死亡途径，小剂量组H₂O₂(100 μmol/L)以细胞凋亡为主，大剂量组H₂O₂(400 μmol/L)以细胞坏死为主，与文献^〔6〕报道一致。本实验还发现，50 μmol/L H₂O₂对H9c2心肌细胞存活率影响不明显时，细胞已有DNA损伤率和凋亡率的增加，且随着暴露剂量增加，DNA损伤和细胞凋亡程度明显增加，说明H₂O₂致H9c2心肌细胞出现坏死前，已造成了DNA损伤。其损伤机制可能是H₂O₂改变细胞膜的通透性，易透过细胞膜造成细胞损伤；而且，H₂O₂产生的ROS可引起细胞内DNA的氢键断裂、碱基降解和主链解旋，这种损伤虽可被DNA修复酶修复，但如果ROS产生过多或DNA损伤未能修复，将对心肌造成不可逆转的损伤^〔7〕。ROS还可以使线粒体膜通透性孔(permeability pore，PT)开放，细胞色素C释放，细胞色素C能与凋亡诱导因子-1(Apaf-1)、半胱天冬氨酸-9(caspase-9)前体形成凋亡体，召集并激活caspase-3，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。H₂O₂造成H9c2大鼠心肌细胞DNA损伤，引起心肌细胞凋亡和坏死，其损伤机制有待于进一步研究。