中国公共卫生  2009, Vol. 25 Issue (2): 217-218   PDF    
引用本文
吴姗芸, 鲁力, 林辉, 鲁文清, 肖德强, 李习艺, 曾高峰. 牛磺酸对苯并(a)芘致L-02细胞损伤保护作用[J]. 中国公共卫生, 2009, 25(2): 217-218.
WU Shan-yun, LU Li, LIN Hui, et al. Effect of taurine on micronuclei formation of L-02 cells exposed to benzo (a) pyrene[J]. Chinese Journal of Public Health, 2009, 25(2): 217-218.
牛磺酸对苯并(a)芘致L-02细胞损伤保护作用
吴姗芸1, 鲁力1, 林辉2, 鲁文清2, 肖德强1, 李习艺1, 曾高峰1     
1. 广西医科大学公共卫生学院营养科学研究中心, 南宁 530021;
2. 华中科技大学同济医学院公共卫生学院职业与环境卫生学教研室
收稿日期: 2008-07-05
基金项目: 广西自然科学基金(桂科自0640115)
作者简介: 吴姗芸(1983-), 女, 广西人, 硕士在读, 研究方向:营养与健康。
通讯作者: 鲁力
摘要: 目的 研究牛磺酸对苯并(a)芘(B(a)P)致人胚肝细胞(L-02细胞)染色体损伤的保护作用. 方法 以L-02细胞为靶细胞, 按完全随机设计分成5组:(1)空白对照组; (2)溶剂对照组; (3) B(a)P染毒组:设12.5, 25, 50μmol/L3个剂量染毒细胞; (4)牛磺酸组:设1.0, 2.0, 4.0mmol/L3个浓度, 加入培养体系后继续培养24h;(5)牛磺酸预防组:L-02细胞先以3个不同浓度的牛磺酸预处理24h, 再加入25μmol/L的B(a)P培养24h.各组均设3个平行样.收获细胞后用微核实验检测染色体损伤, 计算微核率和核分裂指数. 结果 牛磺酸单独作用于L-02细胞时, 与空白对照组比较, 中、高浓度牛磺酸诱导的微核率降低, 核分裂指数增高, 差异有统计学意义.从低到高3个剂量B(a)P单独染毒L-02细胞诱导的微核率为(34.67±2.52), (45.33±4.16), (60.00±7.21)%.核分裂指数分别为1.326±0.034, 1.228±0.006, 1.148±0.012, 与溶剂对照组比较微核率升高, 核分裂指数降低, 差异有统计学意义, 且两者均呈明显的剂量-反应关系.低、中、高浓度牛磺酸预防组诱导的微核率对应为(30.33±3.51), (25.67±1.53)和(23.00±1.00)%.均比单纯25μmol/LB(a)P染毒组诱导的微核率降低, 差异有统计学意义.低、中、高浓度牛磺酸预防组对应的核分裂指数为1.455±0.011, 1.474±0.015和1.1492±0.013, 比单纯25μmol/LB(a)P染毒诱导的核分裂指数高, 差异有统计学意义, 且两者均呈剂量-反应关系. 结论 B(a)P能诱导肝细胞染色体损伤, 且存在明显的剂量-反应关系; 牛磺酸预处理对B(a)P引起的肝细胞毒性具有明显保护作用.
关键词： 牛磺酸     苯并(a)芘     人胚肝细胞     微核实验    
Effect of taurine on micronuclei formation of L-02 cells exposed to benzo (a) pyrene
WU Shan-yun, LU Li, LIN Hui, et al     
Nutritional Scientific Research Center, School of Public Health, Guangxi Medical University Nanning 530021, China
Abstract: Objective To investigate the protective effect of taurine on chromo some damage of human derived fetal hepatocytes (L-02 cells) induced by benzo (a) pyrene (B(a)P). Methods L-02 cells were randomized divided into 5 groups:blank control group (Ⅰ); solvent control group (Ⅱ); B(a)P group (Ⅲ):exposed to B(a)P at concentration of 12.5, 25, 50 mol/L, in culture medium for 24 ho urs; taurine group (IV):exposed to taurine at the concentration of 1.0, 2.0, 4 0mmol/L in culture medium for 24 hours; taurine preventive group (V):exposed to taurine at three different concentration in culture medium for 24 hours and treated further for 24 hours by add ing 25 mol/L B(a)Pinto the culture media.Chromo some damage was detected by cytok inesis block mic ronucleus assay (CBMNT).The frequencies of MN (%) and nucleidivision index (NDI) were calculated. Results Compared with the blank control, taurine at concentrations of 2.0 and 4.0mmol/L induced a significant decrease in MN frequencies and an increase in NDI in L-02 cells.Compared with the solvent control, B(a)Pat concen trations of 12.5, 25 and 50 mol/Linduced a significant enhancement of MN frequencies and reduce in ND I.Compared with the 25 mol/LB(a)P group, pretreatment with taurine could induce a significant decrease in MN frequencies and an increase in NDI in L-02 cells.The reductions of MN frequency and NDI showed a dose effect manner. Conclusion B(a)P could induced chromo some damage in dose effectmanner.Taurine could play a protective role in hepaticcy to toxicity induced by B(a)P.
Key words: taurine     B(a)P     L-02 cells     micro nuclei test    

苯并(a)芘[Benzo (a) Pyrene, B(a)P]在体内主要由肝脏代谢, 经酶代谢活化可生成终致癌物, 引起DNA损伤, 启动致突变、致癌过程〔1〕。牛磺酸(taurine)是体内含量最丰富的氨基酸, 研究发现牛磺酸可通过减轻脂质过氧化, 而拮抗某些毒物、药物的肝毒性, 并有拮抗人胚肝细胞(L-02细胞) DNA损伤的作用〔2, 3〕。鉴于人胚肝细胞有较完整的代谢酶系, 本课题通过微核实验观察B(a)P致人胚肝细胞的微核率和核分裂指数, 研究染色体的损伤及牛磺酸对其的保护作用。

1 材料与方法 1.1 材料

人胚肝细胞(武汉大学中国典型培养物保藏中心); B(a)P、二甲基亚砜(DMSO)、牛磺酸、细胞松弛素B (美国Sigma公司); DMEM培养基和新生小牛血清(美国Gibco公司); 胰蛋白酶(美国Amresco公司); 其他试剂皆为国产分析纯。

1.2 细胞培养

L-02细胞在含10%新生小牛血清的DMEM培养基中, 于37℃、5% CO2的培养箱中培养。L-02细胞生长状态良好, 处于对数生长期时可用于实验。

1.3 胞质分裂阻滞法微核实验(CBMNT)

将L-02细胞按5×105接种于100 ml细胞培养瓶中, 加10%新生小牛血清, 再加DMEM培养基至5 ml。于37℃、5% CO2的培养箱中培养24 h后, 当细胞密度为50%~60%时开始实验。牛磺酸设1.0, 2.0, 4.0 mmol/L 3个浓度, B(a)P设12.5, 25, 50 μmol/L 3个剂量。实验按完全随机设计分成5组:(1)空白对照组; (2)溶剂对照组:加入DMSO; (3) B(a)P染毒组; (4)牛磺酸组:各个浓度加入培养体系后继续培养24 h; (5)牛磺酸预防组:L-02细胞先以3个不同浓度的牛磺酸预处理24 h, 再加入25 μmol/L的B(a)P培养24 h。5个组每种物质、每种浓度均设3个平行样。染毒结束后更换培养基, 加入10 μl细胞松弛素B (3 μg/ml), 培养24 h。收获细胞时, 通过胰蛋白酶消化细胞, 收集细胞离心后用KCl低渗处理细胞, 再次同样条件和时间离心后加入固定液(乙酸和甲醇按3:1比例配制), 离心, 重复固定2次后滴片, 以10%的Giemsa染色13 min, 用清水冲洗风干后用树胶封片保存。每个样本在光学显微镜400×10倍镜下记数单核、双核、三核及四核细胞, 总数记达500个以上。计算核分裂指数(NDⅠ)=(MⅠ+2MⅡ+3MⅢ+4MⅣ)/总细胞数, 其中MⅠ至MⅣ分别代表单核细胞到四核细胞的细胞数。同时计数1000个双核细胞中的微核(MN)数〔4〕。

1.4 统计分析

所有数据采用SPSS 10.0统计软件进行统计处理, 计量资料进行单因素方差分析, 各实验组与对照组间比较用Dunnett-t检验。

2 结果 2.1 牛磺酸对L-02细胞单独作用时微核的影响(表 1)
表 1 牛磺酸对L-02细胞单独作用的微核率和核分裂指数(x±s)

表 1可见, 与空白对照组比较, 2.0和4.0 mmol/L牛磺酸作用于L-02细胞诱导的微核率明显降低, 差异有统计学意义(P < 0.05)。而1.0 mmol/L牛磺酸作用于L-02与空白对照组微核率比较, 差异无统计学意义, 核分裂指数与其相一致。

2.2 B(a)P对L-02细胞单独染毒时微核的影响(表 2)
表 2 B(a)P单独染毒及牛磺酸预处理再染毒B(a)P致L-02细胞的微核率和核分裂指数(x±s)

用B(a)P对L-02细胞单独染毒时, 可见随着B(a)P浓度的升高, 其诱导的微核率与溶剂对照组(DMSO)相比, 呈剂量依赖性显著升高, 差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。B(a)P所有染毒浓度所产生的NDI与DMSO对照组相比均有显著下降, 差异有统计学意义(P < 0.01)。

2.3 牛磺酸预处理对B(a)P致L-02细胞毒性的保护作用(表 2)

牛磺酸预处理L-02细胞后再加B(a)P染毒, 可观察到与单纯25 μmol/L B(a)P相比, 其诱导的微核率有随牛磺酸浓度增加而减少的趋势, 差异有统计学意义(P < 0.01)。1.0 mmol/L牛磺酸预处理组所诱导的微核比DMSO对照组高, 差异有统计学意义(P < 0.05);而2.0和4.0 mmol/L牛磺酸预处理组g与DMSO对照组比较差异无统计学意义。与单纯25 μmol/L B(a)P染毒比较, 牛磺酸预处理组使NDI明显升高, 呈剂量依赖性地显著升高, 差异有统计学意义(P < 0.01)。

3 讨论

实验结果显示, B(a)P在12.5, 25, 50μmol/L的剂量条件下, 诱导的微核率明显增多, 核分裂指数明显降低, 且存在明显的剂量-反应关系。而1.0, 2.0, 4.0 mmol/L的牛磺酸预处理对25 μmol/LB(a)P引起的染色体损伤则具有明显的拮抗作用。

B(a)P在体内肝细胞线粒体P-450酶系的催化下, 可生成环氧化物并与DNA结合, 形成环氧化加合物引起DNA损伤, 从而启动致突变、致癌过程〔5〕。Garry S等发现, B(a)P 0.75 mg单独给予大鼠后, 用彗星实验检测其可引起肝细胞的DNA损伤〔6〕。本研究结果也表明, B(a)P对人胚肝细胞有染色体损伤的毒性作用, 随着B(a)P剂量的升高, 其毒性也增大。

牛磺酸为机体条件必需氨基酸, 可由食物供给或肝脏合成, 在人类一次性最高给予剂量达5 g时仍未观察到任何毒副作用。本研究显示, 不同浓度牛磺酸单独作用于L-02细胞时, 均未引起染色体损伤, 且中高剂量的牛磺酸诱导的微核率比空白对照组还低。Erman F等发现, 牛磺酸可以预防用乙醇与CCl4诱导的大鼠肝纤维化及脂质过氧化损伤〔7〕。宋樱〔8〕等研究发现, 牛磺酸对CCl4诱导的大鼠肝细胞损伤有保护作用。本实验结果显示, 经牛磺酸预处理的L-02细胞再染毒B(a)P, 所诱导的微核率与核分裂指数与单纯B(a)P染毒组相比, 染色体损伤随牛磺酸浓度增加逐渐减轻, 差异有统计学意义。表明牛磺酸对B(a)P致L-02细胞的染色体损伤具有保护作用, 且牛磺酸浓度越高, 保护作用越强。

综上所述, 牛磺酸对B(a)P诱导的肝细胞染色体具有良好的保护作用, 且牛磺酸可通过食物摄取, 无毒副作用, 表明牛磺酸可用于肝损伤及肝癌预防和治疗。

参考文献
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[7] Erman F, Balkan J, Cevikbas U, et al. Betaine or taurine administration prevents fibrosis and lipid peroxidation induced by rat liver by ethanol plus carbon tetrachloride intoxication[J]. Amino acids, 2004, 27(2) : 193–204. DOI:10.1007/s00726-004-0107-3
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