研究表明，饮酒与2型糖尿病的发病存在一定的相关关系^〔1-5〕，同时脂肪组织在机体胰岛素抵抗的重要地位备受关注^〔6-8〕。为了探讨酒精与胰岛素抵抗的关系及其可能的分子机制，本实验观察了不同剂量酒精对大鼠胰岛素敏感性的影响以及对脂肪组织中胰岛素信号途径中关键分子胰岛素受体(insulin receptor, IR)、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1, IRS-1)表达水平的影响。结果报告如下。

(1)实验动物：清洁级雄性Wistar大鼠40只，体重140~160 g (湖北省医学实验动物中心，批号：医动字第19-084号)。(2)试剂与仪器：无水乙醇(武汉江夏中南精细工厂)；血糖试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)；碘^〔125〕I胰岛素放射免疫试剂盒(北京科美东雅生物技术有限公司)；Trizol试剂，逆转录酶(AMV-RT)、随机引物、RNA酶抑制剂、dNTPs、Taq DNA聚合酶及DNA marker (100-1 000 bp)(美国Promega公司)；IR、IRS-1、β-actin引物由北京奥科生物技术公司合成；Elx-800酶标仪(美国Bio-Tek公司)；PCR仪、TI1全自动凝胶成像及分析系统(美国Biometra公司)；5 804 R低温高速离心机与核酸蛋白质分析仪(德国Eppendorf公司)。

动物适应性喂养1周后，按体重随机分为4组。每组10只。正常对照组：蒸馏水灌胃；低剂量酒精组：10%酒精灌胃；中剂量酒精组：20%酒精灌胃；高剂量酒精组：30%酒精灌胃；各组灌胃剂量均为10 ml/(kg·bw)，每天各组灌胃酒精剂量分别为0，0.8，1.6，2.4 g/(kg·bw)。灌胃于每日上午进行。每5只/笼饲以粉状饲料，自由进水进食。环境温度18~22 ℃，湿度45%~50%，自然采光。每周称重，并根据体重的变化调整灌胃量；实验时间为19周。

实验19周末，大鼠禁食8 h后断头处死，分离血清于-70 ℃冰箱保存。血糖、血胰岛素分别用葡萄糖酶氧化法、竞争性放射免疫分析法检测。HOMA-IR=FINS×FPG/22.5。FPG为空腹血糖、FINS为空腹胰岛素。由于HOMA-IR不呈正态分布，取其自然对数后进行统计分析。

大鼠处死后迅速分离相同位置的脂肪组织，置液氮冷冻后转移至-70 ℃冰箱保存。按Trizol试剂盒说明书方法提取组织总RNA，将mRNA逆转录为cDNA，逆转录产物进行β-actin、IR、IRS-1基因扩增。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用Biometra全自动凝胶成像分析系统对各组间mRNA表达进行处理和灰度比较。结果均经β-actin校正。各基因由基因库中查得相应的cDNA的序列，引物由北京奥科公司合成。(1)引物序列IR：5′-TTC ATT CAG GAA GAC CTT CGA-3′5′-AGG CCA GAG ATG ACA AGT GAC-3′扩增产物长度(222 bp)；IRS-1：5′-AGA GTG GTG GAG TTG AGT TG-3′5’-GGT GTA ACA GAA GCA GAA GC-3′扩增产物长度(277 bp)；β-actin：5′-CAT CAC TAT CGG CAA TGA GC-3′5′-GAC AGC ACT GTG TTG GCA TA-3′扩增产物长度(156 bp)(2)反应条件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃(IR，IRS-1，β-actin)45 s，72 ℃，50 s，30 cycles；72 ℃ 7 min。

采用SPSS 12.0软件进行多组间的方差(ANOVA)分析。

实验期间雄性各组大鼠体重呈上升的增长趋势。与对照组相比，低、中剂量组体重增长速度稍快，高剂量组稍慢，但差异均无统计学意义。表明实验期间酒精摄入对大鼠体重无明显影响。

表 1

表 1 酒精对胰岛素浓度、胰岛素抵抗指数的影响(x±s)

表 1 酒精对胰岛素浓度、胰岛素抵抗指数的影响(x±s)

表 1可见，与对照组相比，各剂量组血糖浓度随剂量增加而增加，高剂量组血糖升高差异有统计学意义(P < 0.05)；低、中剂量组血胰岛素浓度升高(P < 0.05)，高剂量组升高，但差异无统计学意义；各剂量组HOMA-IR值均显著高于对照组(P < 0.05)。

图 1

注：Maker:100-1000 bp; C:对照组；L：低剂量酒精组；M：中剂量酒精组；H：高剂量酒精组。 图 1 慢性酒精摄入对脂肪组织IR IRS-1mRNA表达水平的影响

表 2

表 2 酒精对雄性大鼠脂肪组织IR、IRS-1 mRNA表达的影响(x±s, n=3)

表 2 酒精对雄性大鼠脂肪组织IR、IRS-1 mRNA表达的影响(x±s, n=3)

表 2可见，各剂量组IR，IRS-1mRNA表达均较对照组升高，差异均有统计学意义，酒精剂量组IR IRS-1 mRNA表达呈先升高后降低的趋势，中剂量组IR IRS-1 mRNA表达升高最为显著。

分析结果可见，酒精作用大鼠19周，酒精剂量≥0.8 g/(kg·bw)时，大鼠胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)明显升高，雄性大鼠胰岛素敏感性降低，大鼠发生胰岛素抵抗。本文结果与文献^{〔9, 10〕}结果不一致，原因可能是酒精的剂量和作用时间不同所致。提示在进行酒精与胰岛素敏感性关系的研究中，酒精剂量和酒精作用时间是2个重要的参数。

胰岛素受体(insulin receptor, IR)与胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1, IRS-1)是胰岛素信号转导过程中关键分子。有文献证明，IR和IRS-1活性和表达的改变与胰岛素抵抗和2型糖尿病有关^〔11〕。本文结果显示，各酒精剂量组均发生胰岛素抵抗，而各组脂肪组织IR IRS-1mRNA表达升高。可能是在酒精引起机体胰岛素抵抗初期机体的一种代偿反应，然而脂肪组织中这种代偿现象并不能拮抗酒精对大鼠胰岛素敏感性的损害。根据本次结果认为，慢性酒精摄入引起脂肪组织IR，IRS-1mRNA表达水平的改变可能是酒精引起机体胰岛素抵抗的分子机制之一。