细菌耐药性已经成为影响公众健康和感染性疾病治疗的重要问题^〔1〕。现在除医院内感染外，社区获得性感染疾病也在增加^〔2〕，环境中耐药因子对细菌耐药性传播也具有重要意义。耐药质粒的接合转移是细菌获得抗生素抗性的重要途径，且质粒的接合转移是一个被高度调控的过程^{〔3, 4〕}，受许多环境因素，包括环境污染物的影响。纳米材料作为一种可能的环境污染物质，其生态安全问题受到广泛关注^{〔5, 6〕}。为研究纳米材料与接合型耐药质粒同时存在于水体中，纳米材料是否能影响质粒的接合转移，本文以接合质粒大肠埃希菌(E.coli) HB101 (RP4)为研究对象，探讨纳米级氧化铝颗粒对液相条件下质粒接合转移的影响及其规律。

接合供体菌株大肠埃希菌(Escherichia coli) HB101 (RP4)(澳大利亚British Columbia大学Davies教授惠赠)，RP4属于IncP α型质粒，具有卡那霉素、青霉素以及四环素三重抗性；受体细菌Salmonella aberdeen Kauffmann50312(北京天坛医学细菌中心)，经本实验室诱变，获得链霉素抗性株(str^R)，被命名为MS1；卡那霉素、硫酸链霉素、纳米氧化铝悬液(美国Sigma公司)；纳米氧化铝原液为1 mol/L，其粒径20 nm左右，在水中分散良好，用超纯水稀释至100，10，1，0.1，0.01 mmol/L备用；胰蛋白胨和酵母粉(英国Oxoid公司)。

HB101(RP4)和MS1过夜振荡培养，弃培养液，用生理盐水稀释，供受体菌比例调节到1：3，于25 ℃静止接合，接合过程参照文献〔7〕。实验组氧化铝终浓度分别为50，5，0.5，0.05，0.005 mmol/L，空白对照组加入等体积的超纯水，每组设置3个平行样。

观察纳米氧化铝对不同浓度RP4接合转移的影响规律时，将菌液稀释至10⁴~10⁸ cfu/ml，25 ℃静止接合8 h，计算转接合子数。观察纳米氧化铝对低浓度RP4液相接合转移影响的时间规律时，将菌液稀释至10⁴~10⁸ cfu/ml，25 ℃静止接合8，18，42，65，90 h时计算转接合子数。

MS1通过接合转移获得RP4，产生的转接合子同时具有卡那霉素和链霉素抗性，因此，用含有30 mg/L链霉素和20 mg/L卡那霉素的水解酪蛋白胨琼脂平板筛选接合子。同时为了排除HB101或MS1自发突变子的干扰，分别设立HB101(RP4)对照组和MSl对照组，以检验双抗平板筛选的耐药细菌均是转接合子。各对照组分别加入上述浓度的纳米氧化铝，处理及筛选方法与接合组同。

采用SPSS 11.0统计软件进行t检验。

表 1

表 1 纳米Al2O3对不同浓度RP4转接合子数的影响

表 1 纳米Al2O3对不同浓度RP4转接合子数的影响

25℃静止培养8 h时后，HB101(RP4)对照组、MS1对照组在链霉素和卡那霉素的双抗平板上均没有细菌生长，表明利用双抗平板筛选出的耐药菌均是转接合子。

接合菌浓度为10⁶~10⁸ cfu/ml时，随着Al₂O₃浓度升高，转接合子数具有上升的趋势，至Al₂O₃浓度为5 mmol/L时达到最高，而后开始下降。除5 mmol/L Al₂O₃始终非常显著地促进接合转移外(P < 0.001)，其余浓度的纳米Al₂O₃对接合的影响与接合菌液浓度有关。接合菌浓度为10⁸ cfu/ml时，50 mmol/L Al₂O₃组转接合子数明显升高(P < 0.001)，0.5 mmol/L Al₂O₃对接合没有影响。当接合菌浓度降低至10⁷和10⁶ cfu/ml时，0.5 mmol/L Al₂O₃组接合子数显著高于空白对照组，而50 mmol/L Al₂O₃组与空白对照组差异无统计学意义(P < 0.05)。当接合菌浓度约为10⁵和10⁴ cfu/ml时，实验组与空白对照组均检测不到转接合子。

图 1

与空白对照组比较 ，P < 0.001。 图 1 纳米Al2O3影响低浓度RP4接合转移的时间规律

接合菌液浓度为10⁵ cfu/ml，接合18 h时，空白对照组几乎没有转接合子产生，0.5 mmol/L Al₂O₃组转接合子数超过了200 cfu/ml，表明0.5 mmol/L Al₂O₃不仅能促进该条件下RP4的接合转移效率，还能缩短转接合子出现的时间。在随后的观察时间内，该组转接合子数持续增长，增长速率和转接合子数始终显著高于空白对照组。5 mmol/L Al₂O₃组在观察时间内均无接合子产生，表明能抑制接合过程。接合菌液浓度为10⁴ cfu/ml。时，各组均检测不到接合子。注：与空白对照组比较，P < 0.001。

在5 mmol/L纳米Al₂O₃干预下，10⁸ cfu/ml HB101(RP4)接合8 h后转接合子数上升约1 000倍。降低接合菌液浓度至10⁵ cfu/ml，延长接合时间，结果0.5 mmol/L Al₂O₃组接合率远远高于接合菌液浓度为10⁸ cfu/ml时RP4的接合率，由此可见，纳米Al₂O₃能促进质粒接合转移，即使低浓度纳米材料长时间作用的影响也不可忽视。如果耐药接合质粒与纳米材料同时存在于水环境中，纳米材料就有可能会促进耐药质粒在细菌间接合转移，并且可能进一步通过食物链在植物、动物及人体间传播，引起食源性病原菌耐药性增加，可见纳米材料是危害水环境安全的可能因素。

接合转移是通过细胞的直接接触，质粒DNA从供体细菌单向转移到受体细菌中去的过程。该过程依赖于接合基因的表达。RP4接合基因的表达受到高度调控^{〔3, 4〕}。纳米材料具有小尺寸和大比表面积的特性，能在细胞、亚细胞以及蛋白水平产生生物效应^〔8〕。纳米Al₂O₃能够促进接合转移的发生，可能通过改变细菌的生理状态，或者直接调控接合基因的表达引起。

综上所述，纳米Al₂O₃可能会促进耐药质粒的接合转移，从而提高食源性病原菌的耐药性，纳米材料在水环境中的安全问题值得重视。