脑缺血是一种以微循环血流量下降和葡萄糖/能量代谢障碍为特征的神经系统疾病^〔1〕。在脑梗塞治疗中, 缺血半暗带区(ischemic penumbra, IP)成为治疗的主要目标, 改善半暗带使之成为正常灌注区是治疗的关键。研究显示, 补充叶酸(FA)、维生素B₆(VB₆)及维生素B₁₂(VB₁₂)能降低体内同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)水平和脑血管疾病发生的危险性^〔2〕。为探讨叶酸及其联合VB₆及VB₁₂对脑缺血大鼠缺血半暗带区的影响与机制, 为临床预防脑血管疾病提供依据, 本研究模拟大鼠局灶性脑缺血模型-中脑动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO), 采用核磁共振成像(MRI)技术观察了预防性给与叶酸及其联合VB₆及VB₁₂, 对缺血半暗带区的改善效果。结果报告如下。

(1)实验动物: SD成年大鼠24只(北京大学医学部实验动物中心), 体重200~280 g, 雌雄各半, 分笼喂养。(2)试剂与仪器:叶酸(FA)、维生素B₆(VB₆)和维生素B₁₂(VB₁₂) (美国Sigma公司); GE 1.5T Twin Speed Infiuity with Excite Ⅰ超导型磁共振成像系统(德国西门子公司)。

(1)分组:大鼠随机分为MCAO组; MCAO+叶酸组(MCAO + FA); MCAO+复合维生素组(CV) (MCAO + CV); 每组8只, 雌雄各半。MCAO组生理盐水10 ml/ (kg·bw)灌胃; MCAO + FA组叶酸溶液10 ml/ (kg·bw)灌胃, 叶酸含量为4 mg/(kg·bw); MCAO + CV组复合维生素溶液10 ml/(kg·bw)灌胃, 其中叶酸4 mg/(kg·bw), VB₆ 12 mg/(kg·bw), VB₁₂ 24μg/(kg·bw)。(2)模型制备:预防性给药28 d后, 制备大鼠局灶性脑缺血模型-中脑动脉闭塞(MCAO)模型^〔3〕, 造模术后1和6 h进行脑部核磁共振成像(MRI)扫描。

使用GE 1.5T Twin Speed Infiuity with Excite Ⅰ超导型磁共振成像系统, 3寸表面线圈, T2WI (TR/TE /NEX 4000/102/2), 层厚3 mm, 层间隔0 mm, 视野(FOV) 8 cm × 8 cm, 矩阵256 × 256。进行弥散加权成像(DWI)、弥散张量成像(DTI)检查; 计算表观弥散系数(apparent diffusion coefficient, ADC)、平均弥散系数(average diffusion coefficient, DCavg)和部分各向异性(fractional anisotropy, FA)。观察MCAO组、MCAO + FA组和MCAO + CV组的DWI、DTI图像变化。根据病变不同表现, 分别在DWI图像上以异常信号为中心, 向异常信号边缘划直线, 将直线3等分, 各等分点作为切点1, 2, 3, 4, 观察测定缺血部位第2, 3、4切点的ADC、Dcavg和FA值。其中第2切点代表近缺血中心区, 第3切点代表缺血边缘区, 第4切点代表边缘区邻近的正常信号区。缺血中心以外区域具有易变性, 随着时间推移, 中心区由第2切点向第3切点不断扩大, 则判定第2切点和第3切点之间区域即为缺血半暗带区(IP)。为了评价指标更客观, 避免大鼠大脑各部分差异对实验结果的影响, 采用病变侧与正常对照侧比值, 即相对ADC (relative ADC, rADC), 相对DCavg (relative DCavg, rDCavg)和相对FA (relative FA, rFA)进行分析。

采用SPSS 11.5软件进行统计分析, 多组间比较用单因素方差分析。

表 1

表 1 缺血后1 h和6 h各组rADC值比较(n=8, x±s)

表 1 缺血后1 h和6 h各组rADC值比较(n=8, x±s)

缺血1 h后, 各切点rADC值的组间差异无统计学意义; 但各组第3切点rADC值均高于第2切点(P < 0.05)。缺血6 h后, MCAO + FA组第3切点rADC值高于MCAO组, MCAO + CV组各点rADC值均高于MCAO组(P < 0.05);各组第3切点rADC值仍高于第2切点, 但低于第4切点(P < 0.05)。

表 2

表 2 缺血后1 h和6 h各组rDCavg值比较(n=8, x±s)

表 2 缺血后1 h和6 h各组rDCavg值比较(n=8, x±s)

缺血1 h后, 各组间rDCavg值差异无统计学意义, 各组的第3切点rDCavg值与第2, 4切点差异也无统计学意义。缺血6 h后, MCAO + FA组和MCAO + CV组第3, 4切点rDCavg值均高于MCAO组(P < 0.05);各组第4切点rDCavg值均高于第3切点, MCAO + FA组和MCAO + CV组第3切点高于第2切点(P < 0.05)。

表 3

表 3 缺血后1 h和6 h各组rFA值比较(n=8, x±s)

表 3 缺血后1 h和6 h各组rFA值比较(n=8, x±s)

缺血1 h后, MCAO + FA组和MCAO + CV组第3、4切点rFA值低于MCAO组, MCAO组第3切点rFA值高于第2切点, 低于第4切点(P < 0.05), MCAO + FA组和MCAO + CV组第3切点低于第4切点(P < 0.05)。缺血6 h后, MCAO + FA组第4切点rFA值高于MCAO组(P < 0.05), MCAO + CV组各切点均高于MCAO组, 且第4切点高于MCAO + FA组(P < 0.05)。各缺血区比较, 各组第3切点rFA值均高于第2切点, MCAO + FA组和MCAO + CV组第4切点也高于第3切点(P < 0.05)。

缺血神经损害分为3个带, 靠近中心损害最为严重的是缺血核心区, 靠近核心区的是IP区, 再向周边是血流减少区。缺血中心区扩大主要由IP进行性恶化造成^〔4〕。本研究将半暗带观察时间定为1和6 h, 探讨半暗带的动态变化。由于大鼠脑缺血对侧脑组织即为正常对照, 因此, 本研究未设立假手术对照组。

结果显示, 随着时间推移, 核心区由第2切点向第3切点不断扩大, 有理由认为第2, 3切点之间区域为IP。缺血6 h后的结果表明, 补充叶酸、VB₆和VB₁₂可以抑制半暗带区ADC值的下降, 以抑制缺血核心区的扩大, 联合补充效果优于单独补充叶酸。缺血1 h以内, 如出现FA值的升高, 可能由于急性脑组织缺血, 造成细胞毒性水肿^〔5〕, 而MCAO + FA组和MCAO + CV组半暗带及边缘区的FA值低于MCAO组, 说明补充叶酸、VB₆和VB₁₂可以减少细胞毒性水肿。但随着水肿发展为血管源性水肿时, FA值会下降, 而MCAO + FA组和MCAO + CV组缺血后6 h的半暗带区的FA值又高于MCAO组, 说明血管源性水肿也得到了控制。

本研究发现, 叶酸可以减轻脑水肿, 阻止缺血核心区的扩大, 而且与其联合补充VB₆和VB₁₂的效果更明显。可能与脑缺血损伤导致高同型半胱氨酸, Hcy诱导神经细胞凋亡, 阻碍神经损伤和功能的恢复^〔6〕, 而叶酸、VB₁₂和VB₆参与Hcy代谢降低其浓度有关。