2009, Vol. 25
2. 教育部和卫生部心血管重构和功能研究重点实验室山东大学齐鲁医院心内科;
3. 山东大学附属济南市中心医院心内科
鸟苷酸结合蛋白(G蛋白)是一组具有三磷酸鸟苷(GTP)结合、水解活性的蛋白质, 在细胞膜受体和效应蛋白间的信息传递过程中起中介作用〔1〕。G蛋白β3亚单位(GNB3)基因存在C825T多态性, 目前该基因多态性与原发性高血压(EH)关系, 不同的研究之间差异较大〔2-4〕。血管紧张素原(AGT)是血管紧张素的前体物质, 参与肾素-血管紧张素系统内分泌、旁分泌、自分泌的调节过程, 与血压形成有关。研究发现, 高血压患者中235T等位基因发生频率远高于正常对照组, 235T与血中AGT水平升高相关, 因此, 认为该突变可能与高血压有关〔5〕。本研究旨在探讨原发性高血压家系人群中, 不同信号转导系统的基因多态性致高血压的协同作用。
1 对象与方法 1.1 对象从山东省医学科学院心脑血管病防治研究中心2004~2005年山东省章丘市农村高血压调查中选择原发性高血压家系成员, 包括原发性高血压患者先证者及其一级亲属患有原发性高血压者, 共162例, 其中男性82例, 女性80例, 平均年龄(52.5±8.4)岁。对照组为既往无高血压家族史、无高血压史、无服用抗高血压药物史的的无血缘关系的健康对照人群, 共180人, 其中男性91人, 女性89人, 平均年龄(53.0±8.7)岁。高血压诊断标准根据中国高血压防治指南(2005年修订本)〔6〕:收缩压(SBP)≥140 mmHg和/或舒张压(DBP)≥90 mmHg。排除目前或最近(1月内)使用抗高血压药物者; 有包括冠心病、心衰、中风、外周动脉疾病等心血管疾病病史者; 经常饮酒者; 继发性高血压患者。
1.2 方法 1.2.1 DNA提取取EDTA抗凝静脉血5 ml, 用低渗溶血-盐析法从外周血提取白细胞基因组DNA。
1.2.2 GNB3基因PCR扩增与酶切PCR引物:上游引物5′ -CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT -3′, 下游引物5′-GAT-GTCCCCATCACATTCGTCAGAT -3′, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应体系为25 μl, DNA模板25 ng, Mg2+离子终浓度为2.0 mmol/L, 4种dNTP终浓度为0.2 mmol/L, 引物工作液浓度为0.1μmol/L, 0.4 U Taq酶。反应条件为: 95℃预变性5 min, 然后94 ℃ 45 s, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 45 s进行35个循环, 终末延伸72 ℃ 5 min。取3μl PCR产物, 经2%琼脂糖电泳观察电泳条带分子量大小。用1 U BseD I限制性内切酶37℃水浴过夜。酶切产物经3%琼脂糖电泳, 紫外灯下判定基因型。
1.2.3 AGT基因PCR扩增与酶切PCR引物:上游引物5′ -GATGCGCACAAGGTCCTGTC -3′, 下游引物5′-CAGGGT-GCTGTCCACACTGGACCCC -3′, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为100μl: DNA模板50 ng, Mg2+离子终浓度为2.0 mmol/L, 4种dNTP终浓度为0.2 mmol/L, 引物工作液浓度为0.1μmol /L, 4 U Taq酶。反应条件为: 94℃预变性3 min, 然后94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s进行35个循环, 终末延伸72 ℃ 10 min。取10 μl PCR产物, 经2%琼脂糖电泳观察电泳条带分子量大小。用PsyⅠ限制性内切酶37 ℃水浴3 h。酶切产物经3%琼脂糖电泳, 紫外灯下判定基因型。
1.3 统计分析采用SPSS 12.0软件进行分析, 计量资料采用x±s表示, 计数资料用%表示。基因型、等位基因频率和组间计数资料间比较采用χ2检验, 2组均数间比较采用t检验, 相关分析采用Logistic回归分析。
2 结果 2.1 基本情况2组人群的年龄、性别比例、体质指数均值等差异无统计学意义, 高血压组收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、脉压差(PP)分别为(151.4±17.9), (94.6±10.7), (56.5±15.8) mmHg, 均高于对照组, 分别为(122.6±13.6), (76.8±7.2), (45.6±9.4) mmHg, 差异均有统计学意义(P < 0.05)。
2.2 多态性分析 2.2.1 GNB3基因C825T多态性(图 1, 2)
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图 1 GNB3基因PCR产物电泳图 |
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图 2 GNB3基因C825T多态性电泳结果 |
观察对象DNA经PCR扩增产物为268bp的片断; 若在此片断不存在825C→ T位点突变, 则产生限制性内切酶Bse D I的位点, 酶切后得到片断大小为152和116bp 2个片断。基因型为CC型; 若含有C→T位点突变, 酶切后得到大小为268 bp的片断, 基因型为TT型; 酶切后既得到268 bp, 又得到152和116 bp片断者, 基因型为CT型。
2.2.2 AGE基因M235T基因多态性(图 3, 图 4)
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图 3 ATG基因PCR产物电泳图 |
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图 4 ATG基因M235T多态性电泳结果 |
观察对象DNA经PCR扩增产物为303bp的片断, 依据AGT基因在第2外显子704处核苷酸由胸腺嘧啶(T)置换为胞嘧啶(C), 造成第235位由蛋氨酸变异为苏氨酸(M→T), 可产生3种基因型。产生PsyⅠ酶切识别序列位点, 经PsyⅠ内切酶消化后, 产生AGT基因苏氨酸等位基因纯合型(TT型); 反之, 未产生识别序列位点, 经限切酶消化后为蛋氨酸等位基因纯合型(MM型), 介于其中的为杂合型(MT型)。AGT基因PCR扩增产物为163 bp DNA片段, TT型存在T→C的突变, 则扩增产物经酶切后, 被切成2部分即140和23 bp, 由于23 bp片段小, 一般在电泳后被排除凝胶外, 故只能观察到140 bp的1个条带; MM型保留163 bp 1条带; MT型产生163, 140和23 bp的3个条带, 电泳图可观察到163和140 bp的2个条带。
2.3 GNB3基因C825T多态性和AGT基因M235T多态性与高血压的关系(表 1)
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表 1 2组人群基因型分布及等位基因频率比较 |
2.3.1 GNB3基因C825T多态性与高血压的关系
基因多态性的基因型分布经χ2检验, 符合Hardy-Weinberg定律。EH组与正常对照组GNB3基因C825T基因型构成比的比较, 差异无统计学意义(P > 0.05)。EH组等位基因频率与正常对照组比较, 差异也无统计学意义(P > 0.05)。逐步Logistic回归分析结果显示, GNB3 825T等位基因与高血压发生无显著相关(OR=1.21, P=0.451)
2.3.2 AGT基因M235T多态性与高血压的关系EH组与正常对照组AGT基因M235T基因型构成比差异有统计学意义(P < 0.05); EH组T基因型及T等位基因频率均显著高于正常对照组, 差异有统计学意义(P < 0.05)。逐步Logistic回归分析结果显示, AGT基因M235T多态性的T等位基因, TT纯合子与原发性高血压的发病显著相关(OR=1.47, P=0.028; OR=1.87, P=0.012)。
2.4 GNB3 C825T多态性和AGTM235T多态性联合分析(表 2)|
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表 2 2组人群2种基因多态性联合分析 |
表 2可见, 在AGT TT纯合子中, GNB3 TT纯合子患病率及SBP、DBP值显著高于C等位基因携带者(P < 0.05), 逐步Logistic回归分析结果显示, 825TT + 235TT基因型高血压的发病危险为其他基因型的3.45倍(P=0.001), 825T + 235T等位基因携带者高血压发病危险为其他基因型的2.12倍(P=0.014)。
3 讨论由于高血压家系人群遗传背景及生活方式等方面与正常血压家系的差异, 因此在高血压家系人群与普通人群中进行的高血压致病基因的研究可能会有差异〔7〕。本文单基因结果分析显示, EH组与正常对照组GNB3基因C825T基因型构成比的比较, 差异无统计学意义。EH组等位基因频率与正常对照组比较差异也无统计学意义。逐步Logistic回归分析结果显示, GNB3 825T等位基因与高血压发生的相关关系无统计学意义, 因此, 单纯的GNB3 825T等位基因可能不会导致高血压发病危险的增加。
Glavnik N等的研究〔8〕显示, 无论基因型分布还是等位基因频率在高血压患者和正常对照组中的差异均无统计学意义。本研究结果显示, EH组与正常对照组AGT基因M235T基因型构成比差异有统计学意义, EH组T基因型及T等位基因频率均显著高于正常对照组, 差异有统计学意义。逐步Logistic回归分析结果显示, AGT基因M235T多态性的T等位基因, TT纯合子与原发性高血压发病的相关性差异有统计学意义(OR=1.47, P=0.028; OR=1.87, P=0.012)。因此, AGT基因235T等位基因可能为山东汉族人群高血压高发家系人群高血压发病的一个危险因素。
本文结果显示, 在AGT TT纯合子中, GNB3 TT纯合子患病率及SBP、DBP值显著高于C等位基因携带者(P < 0.05);逐步Logistic回归分析结果显示, 825TT + 235TT基因型高血压的发病危险为其他基因型的3.45倍(P=0.001), 其发病危险显著高于单纯的AGT235 TT基因型; 825T + 235T等位基因携带者高血压发病危险为其他基因型的2.12倍(P=0.014)。研究结果提示, 尽管单基因分析未发现GNB3 C825T基因多态性与高血压的相关性, 但是该基因多态性可显著增加AGT 235T等位基因携带者高血压的发病危险, 表明同时具有GNB3基因825T等位基因和AGT 235T等位基因可能是山东省汉族高血压高发家系人群发生高血压的一个危险因素。
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