2008, Vol. 24
2. 山东省医学科学院放射医学研究所, 济南250062;
3. 山西省地方病防治研究所
近年来, 随着分析化学技术的不断发展, 砷化学形态分析方法取得了长足的进步, 尤其是高效液相色谱 (HPLC) 与电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS) 联用技术的应用, 使得砷化合物在自然界和生物体中的摄入、累积、转运、储存、解毒和活化等特性得以不断被识别和确认。在环境和生物系统中存在几十种砷的化合物, 其毒性不同, 生物化学和环境行为各异, 这就要求砷的化学形态分析既要能定性识别, 又要能定量测定。本文对HPLC-ICP-MS联用技术对环境和生物系统中砷化合物形态分析的研究进展作一综述, 以利于进一步深入研究含砷化合物的存在水平、代谢机制和健康影响。
1 HPLC-ICP-MS联用技术自然界和生物系统中存在着20多种砷化合物, 确定样品中每种砷化合物形态十分重要。砷形态分析技术包括不同化学形态砷化合物的分离技术和敏感的定量检测技术。20世纪80年代以后, 对砷检测已达到μg／L水平, 特别是通过ICP-MS方法能准确测定总砷量。然而, ICP-MS分析方法还难以完成砷元素的形态研究, 联用技术是现代分析科学的重要研究手段。自1980年Hirschfeld首次提出联用技术以来, 各种联用技术迅速发展, 其中HPLC和ICP-MS联用技术是发展较为完善的技术之一, 目前该技术己广泛应用于样品中元素的形态分析。HPLC-ICP-MS联用技术融合了HPLC的高效分离和ICP-MS的低检测限、宽动态线性范围及能跟踪多元素同位素信号变化等优点, 可以分离、提纯、富积、分析环境和生物样品中的不同形态砷化合物, 特别对于痕量、超痕量砷来说是最可靠的形态分析方法, 是目前国际上各实验室测量不同形态砷化合物的首选测量方法。
2 HPLC分离砷化合物HPLC适用于分离半挥发性和非挥发性化合物或遇热易被裂解的待测物, 因此, 需要对分析物进行分析前衍生处理的气相色谱 (GC) 分析技术应用范围更广泛。HPLC由于其内在的特点决定了其具有分离的可再现性, 这一点也是缺乏此特性的毛细管电色谱 (CA) 分离方法所不能达到的。HPLC有以下特点： (1) 高压：压力可达150～300kg/cm2, 色谱柱每米降压为75kg／cm2以上。 (2) 高速：流速为0.1～10.0ml/min。 (3) 高效：在1根柱中同时分离成分可达100种。 (4) 高灵敏度：紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱比较有以下优点： (1) 速度快：通常分析1个样品在15～30 min, 有些样品甚至在5 min内即可完成。 (2) 分辨率高：可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 (3) 灵敏度高：紫外检测器可达0.01 ng, 荧光和电化学检测器可达0.1 pg。 (4) 柱子可反复使用：用1根色谱柱可分离不同的化合物。 (5) 样品量少, 容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏, 可以收集单一组分或做制备。最初HPLC与ICP-MS联合使用时的砷绝对检测限是0.1～0.2 ng。在砷的形态分析中, 离子交换色谱法应用最广泛, 接下来是离子对色谱法。在HPLC-ICP应用于砷形态分析的早期研究中, 利用了离子交换色谱法和离子对色谱法, 其绝对检测限分别是50和300pg。HPLC与ICP-MS联合使用, 为砷形态分析提供了一个很好的分析方法。胶束HPLC也经常用于某些砷化学形态分析。
3 样品处理砷形态分析中为获得准确测量值就需要在样品处理过程中尽量保持其原始浓度和原始形态的化学结构, 正确的取样和样品分离、提纯等处理过程是关键。在砷形态分析研究中, 首先考虑的是样品采集和分离等过程中保持砷的化学结构, 其次是样品污染、样品的代表性、形成沉淀的可能性和容器壁的作用。通常会采用温和的提取方法以防止化学结构改变。已知在含砷样品收集和处理过程中亚砷酸盐 (AsIII) 被氧化为砷酸盐 (Asv) [2], 因此, 需要考虑防止氧化, 可以通过添加样品干扰试验来验证整个样品分析过程中是否有砷化学形态改变。
水中砷的主要存在形式是AsIII和Asv, 在水样的处理和分析过程中已经发现、有的AsIII氧化为Asv。在富含铁离子的水中, 可溶性的砷与铁离子形成不溶的铁沉淀物, 乙二胺四乙酸 (EDTA) 可以防止砷铁沉积[3]。维生素C (VC) 盐酸用来保持水样中AsIII不被氧化, 有时也使用螯合剂。一般情况下, 5价的甲基化胂 (MMAv和DMAV) 稳定性高于3价无机砷和其他有机胂化合物。样品处理一般包括收集、贮存、前处理和分析等步骤, 每一步都有可能改变砷的形态分析结果, 因此, 在样品分析前一定要认真考虑设计合适的样品处理过程。
3.1 样品的收集、贮存和处理在样品收集过程中要考虑保持样品实际的状态。首先要考虑容器壁的作用, 由于选择容器材质不同, 样品中的物质有可能被吸收或丢失。其次是容器的前处理。硝酸经常用于清洗各种材质的容器, 但是残留在容器壁上的微量硝酸可能使容器中贮存的液体样品中的砷化合物氧化, 因此, 要考虑容器前处理的方法。尿样经常贮存于经硝酸前处理过的容器中, 虽然不影响总砷含量的测定, 但是由于容易导致砷氧化, 所以不适合于尿样中砷化学形态分析。因此, 非氧化性酸应适于形态分析样品贮存容器的清洗。盐酸中存在干扰砷元素质谱信号的氯元素, 所以贮存用ICP-MS分析砷化学形态的样品容器不宜用盐酸清洗。样品贮存一般采取低温冷冻保存, 可以尽量降低微生物或酶对待测物质的降解和挥发性物质的丢失。如果容器密封效果不好, 也会导致分子氧引起的氧化和挥发性物质的丢失。微生物可以使无机砷化合物转化为甲基胂化合物, 因此, 需要考虑保持原有状态的贮存方法。另外, 样品从生物或复杂基质上清洗下来的过程中也存在保持化学形态的问题。所以, 可靠的分析研究有必要通过添加样品分析来确认样品贮存和处理过程是否有化学形态的改变。
3.2 样品提取环境或生物样品基体复杂且不同形态砷化合物的浓度很低 (痕量、超痕量级), 难以直接测定, 样品需经预处理后才可以进行仪器分析。样品前处理的目的是对被测组分进行浓缩富集, 消除基体干扰, 提高方法的灵敏度, 降低检测限。由于全球环境污染日益严重, 要求减少使用各种有机溶剂, 所以, 近年来各种高效、快速、溶剂用量少的样品前处理技术得以迅速发展。
液体样品提取包括传统的方法, 如固液萃取或液液萃取、固相萃取 (SPE) 和固相微萃取。固体样品的处理一般包括碾碎、研磨、冻干或过筛, 然后提取。超临界流体萃取 (SFE) 是近年来发展很快的一种样品制备技术。超临界流体的性质介于气体与液体之间, 既有液体的高密度又有气体的高扩散性, 能够渗透到固体内部溶解被测组分。无毒、无污染且化学惰性的CO2是常用的超临界流体, 它特别适用于萃取极性弱的脂溶性有机污染物。SFE具有样品加工方便、快速、易于控制和实现与色谱／质谱仪器联用等优点, 在环境有机污染物分析中有着广泛的应用。微波萃取 (MAE) 是以微波为能量的快速、高效、节能的样品制备方法, 有机溶剂用量少, 同时处理多个样品, 应用领域广泛。加压溶剂提取技术 (PLE) 具有提取时间短、溶剂消耗少、提取效率高等优点, 主要用于环境分析中的样品制备, 也有用于食品中成分分析的前处理。索氏提取 (SE) 是一种经典的样品前处理技术, 在样品没有标准值的情况下经索氏提取的样品测定结果可以作为标准参考值, 但索氏提取时间长, 有机溶剂用量大。固液萃取和SE是目前国内外实验室广泛使用的样品前处理方法。SFE、MAE和PLE等改进技术也都广泛应用于砷化学形态分析。
4 砷形态分析水和土壤是广泛用于检测的环境样品, 砷在这些基质中通常是以无机形式存在。用水、磷酸钠和EDTA为流动相, 阴离子交换等度色谱系统检测水中AsIII、AsV、一甲基胂酸 (MMAV) 和二甲基胂酸 (DMAv) [4]。用水和氢氧化钠为流动相, 阴离子交换等度色谱系统检测土壤中的AsIII、AsV、MMAV和DMAV[5]。在一些地表水的样品中AsIII和AsV为水样中主要的砷化学形态。但是, 近来Ronkart等[6]利用HPLC-ICP-MS联用技术检测到砷甜菜碱 (AsB) 和DMAV, HPLC-ICP-MS检测限接近0.4pg。生物样品包括食物样品、植物、藻类和动物组织。在这些样品基质中, 发现了多种形态的砷化合物。用水、枸橼酸缓冲液和乙二黄酰钠为流动相, 离子对等度色谱系统检测鱼类中的AsIII、AsV、MMAV、DMAV和AsB[7], 发现海产品中一般含砷量比较高, 但是其化学形态一般为无毒的AsB[8, 9]。植物食材因植物种类不同, 各种砷化合物水平不同。例如用水、磷酸钠和硝酸盐缓冲液为流动相, 阴离子交换等度色谱系统检测苹果中的AsIII、AsV、MMAV和DMAV, 发现苹果中无机砷水平为μg／kg水平[2], 所以可以认为苹果不是人类食物中砷的来源。然而, 用水、10 mmol／L磷酸氨为流动相, 阴离子交换等度色谱系统检测大米中的MMAV、DMAV和AsV和用水、4 mmol／L乙酸吡啶为流动相, 阳离子交换等度色谱系统检测大米中的AsIII和AsB, 发现大米含砷化合物水平高[10-13]。临床样品包括胆汁[14, 15]、血液和血细胞[14, 16]、尿液[14-18]、指 (趾) 甲和毛发[19, 20], 强调特殊的砷化合物可以作为人类砷暴露的生物标志物。用水、乙酸和甲酸铵为流动相阳离子交换等度色谱系统检测体液和血液中的AsIII、AsV、MMAV、DMAV和AsB。用水、枸橼酸和硝酸为流动相, 阴离子交换等度色谱系统检测尿中的AsIII、AsV、MMAV、MMAIII、DMAV、DMAIII、AsB和砷胆碱 (AsC) [18]。尿砷是常用的砷暴露标志物, 但是尿中总砷水平与饮食中海产品摄入量和摄入频率密切相关[21]。为避免因食入低毒或者无毒的AsB而高估砷暴露水平, 因此, 包括检测特殊毒性砷生物标志物在内的砷形态分析十分重要。
5 结语HPLC-ICP-MS联用技术作为一种高效、敏感的检测方法将进一步促进砷形态分析研究。微柱HPLC已与ICP-MS联用, 由于流动相只使用少量有机改进剂, 所以是一种更为稳定的等离子体。柱后衍生法的氢化物发生 (HG) 是另外一种分离技术。虽然本文没有涉及HG, 但HG也是一种敏感、低检测限能将分析物有效地运送到ICP-MS检测器的分离装置。Nakazato等[22]利用液相色谱-高效光氧化-氢化物发生-电感耦合等离子体质谱 (LC-HEPO-HG-ICP-MS) 第一次分析了尿样样品中的AsIII、AsV和MMAV等20种砷化合物。由于与ICP-MS接口复杂, 砷形态分析中很少使用HG-ICP-MS, HPLC-ICP-MS几乎主导了砷形态分析领域。
砷形态分析中样品处理是另一个重要技术。首先要考虑萃取过程中保持样品中砷化合物的原有化学结构, 在样品处理过程中应用螯合剂和抗氧化剂。MAE和加速溶剂萃取 (ASE) 等改进技术为提供可编程序和温和的萃取条件提供了平台。
随着检测技术的不断改进与完善, 一些新的砷化合物不断被检测出来, 进一步确认砷化合物特性是今后方向。平行使用电喷雾质谱 (ESI-MS) 与更加敏感的ICP-MS技术是获得结构信息和帮助鉴别砷化合物的先进手段。另外, 增加有效参照化合物和鉴别含特殊形态砷的参考物将有助于砷的形态分析。
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