单增李斯特菌的传统鉴定方法主要是进行生化反应，辅以溶血实验和小鼠毒力试验。这些传统鉴定方法操作复杂、耗时长，鉴定结果易受各种因素影响。近年来各种分子生物学方法开始逐步应用于李斯特菌的检测和鉴定^[1-7]，其中适用于细菌鉴定的方法只有脉冲电场凝胶电泳（PFGE）法、随机扩增DNA多态性(RADP)法、测序法，但由于操作比较繁琐、操作技术和分析能力要求较高，在实际检测中应用并不多。英国沃特曼（Whatman）公司的专利纸片-FTA卡是一种方便保存、提取和转移DNA的新技术手段，能有效地减少微生物检测中的生物安全问题^{[8, 9]}，开始受到微生物学专家的重视。本研究利用FTA卡-16S rRNA基因测序技术鉴定食品中李斯特菌，探讨其应用于实际样品检测中的可能性。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株

（1) 标准菌株：10株，其中单增李斯特菌4株，菌株号ATCC 7644；英诺克李斯特菌2株，菌株号ATCC 33090；西尔氏李斯特菌、威尔斯李斯特菌、格氏李斯特菌各1株，菌株号分别为ATCC 735967，ATCC 35897，ATCC 25401；绵羊李斯特菌1株，菌株号ATCC 19119。（2）单增李斯特菌参考菌株1株,菌株号54002；能力验证菌株3株,其中单增李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌各1株，菌株号分别为T018，T33，T48。（3）分离菌株：26株，其中单增李斯特菌7株；英诺克李斯特菌8株；西尔氏李斯特菌4株；威尔斯李斯特菌4株；格氏李斯特菌2株，绵羊李斯特菌1株(以上菌株分别来自美国MBL公司，中国普通微生物菌种保藏中心，中山大学公共卫生学院，广东环凯生物科技有限公司，广东、中山、江门检验检疫局技术中心及本实验室)；每个菌株均选取2个菌落分纯后进行平行测定。

1.1.2 试剂和仪器

(1) 主要试剂：FTA卡、FTA纯化试剂（英国Whatman公司）；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液等PCR试剂、Tris-乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)三羟甲荃氨基甲烷-乙二胺乙酸二钠（TE）缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）（大连宝生物工程有限公司）。上游引物：5＇-TGGAGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3＇（对应16S rRNA基因的第5～27个碱基）；下游引物：5＇- TACCGCGG CTGCTGGCAC-3＇（对应16S rRNA基因的第532～515个碱基）^[10] 均由大连宝生物工程有限公司合成。（2）主要仪器：2400 PCR仪（美国应用生物系统公司）。

1.2 方法 1.2.1 DNA提取

挑取单个菌落进行纯培养后，制成1×10⁷/ml～10×10⁷/ml范围的菌悬液，吸取100 μl，滴在FTA卡上，室温下干燥1 h以上；用打孔器取直径约2 mm的FTA纸片于1.5 ml离心管中；加入200 μl FTA纯化试剂，稍加混匀后室温下静置5 min，吸去FTA纯化试剂，再加入200 μl FTA纯化试剂重复洗2次。加入200 μl TE缓冲液，稍加混匀后室温下静置5 min，吸去TE，再加入200 μl TE重复洗1次。吸去TE后，56 ℃干燥15～20 min（或于室温下过夜干燥）。此干燥纸片用于PCR反应。

1.2.2 PCR扩增鉴定及测序

PCR反应体系：10×PCR缓冲液3 μl，dNTP混合液（各2.5 mmol/L）2 μl，上、下游引物各1 μl，DNA模板1个纸片（直径2 mm），灭菌去离子水10.9 μl，Ex Taq酶0.1 μl。反应条件：95 ℃ 5 min →（95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s）×40→72 ℃ 10 min。1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)溶液中染色，凝胶成像系统下观察DNA条带。若有500 bp左右的条带，说明PCR扩增成功。扩增成功的PCR产物由大连宝生物工程有限公司完成纯化与测序。

1.3 测序比对分析

采用在线序列比对程序美国国家生物信息中心（NCBI）的BLAST程序^[11]和核糖体数据库计划（RDP）Seqmatch程序^[12]2种比对程序进行16S rRNA基因序列的同源性比对。

2 结果 2.1 实验菌株测序结果比对分析(表 1)

结果表明，本次实验40个菌株的80个菌落通过RDP程序和BLAST程序均得到了正确的结果。

3 讨论

FTA卡是英国Whatman公司的专利产品，由于具有保存方法简单、无需冷藏、提取简单、保存期限长等优点，最近开始逐渐地应用于各种微生物或其他生物体DNA样本的保存和鉴定^{[8, 9]}。本研究使用Whatman公司专用的FTA纯化试剂，无需加热、离心装置，即可将DNA纯化；这是所有其他DNA纯化方法无法比拟的。

本研究表明，应用2种在线序列比对软件的结果完全一致。由于RDP程序是一个专门用于核糖体序列比对的在线软件，它得出的比对结果更直观、清晰，而且运行时间也比BLAST快很多，适合于细菌鉴定中应用。而BLAST软件是一个通用的序列比对软件，由于数据库庞大，程序运行时间相对长一些，但最后提供的序列信息非常充分，适合进行分子分型研究。

由于李斯特菌属中种比较少，而且序列研究比较充分，数据库也比较齐全，因此，应用效果非常好，完全可作为一种鉴定方法在实际工作中应用。但由于16S rRNA基因在种内具有较高的保守性，无法区分亚种以下的分类单位。如需要进行亚种分型，可以考虑利用16S ～23S rRNA基因区隔区的多态性^[13]。