目前，逆转录聚合酶链反应产物通常采用目测、光密度测量、放射自显影或液体闪烁计数技术来定量。这些技术均为半定量、繁琐、有的要用到放射性物质。近几年来，基于杂交分析技术己建立了荧光、比色、化学发光、电化学发光定量方法。比色免疫分析和化学发光分析的稳定性较差，其他分析技术均需利用磁珠，大大地增加了分析测试的成本^[1-3]。

本实验利用水母发光蛋白建立了一种细胞角蛋白19-mRNA(CK19-mRNA)定量检测方法，它具有灵敏度高、简便、非放射性等优点。分析时，先提取总RNA并逆转录为 cDNA,利用特异引物将其进行PCR放大。然后将PCR产物变性并与地高辛标记的探针杂交，带有生物素的杂交产物与包被在微孔板上的链亲合素结合，将水母发光蛋白加入使地高辛和地高辛抗体发生抗原抗体结合反应。加入一定量的钙离子激发水母发光蛋白发射469 nm的蓝光，仪器可对发光强度进行测量。

PCR仪（上海一恒公司）；MicroBeta1450 Liquid Scintillation and Luminescence Counters(美国 PE 公司）。

引物和探针与上海博亚生物技术有限公司共同设计，由该公司合成和修饰；超纯质粒DNA纯化试剂盒（维特杰公司）；Ny coPrep^TM1.077A(挪威 Axis-Shield 公司）；含 CK19 全编码序列的cDNA质粒及非小细胞肺癌H322细胞由本实验室保存。

CKl9片段（754bp),PCR反应上游引物系列：5'-TCC CGC GAC TACAGC CAC TAC TACACG ACC-3;下游引物系列： 5'-CGC GAC TTG ATG TCC ATG AGC CGC TGG TAC-31 ;探针系列：5'-GGT CGT GTA GTA GTG GCT GTA GTC GCG GGA-3C ;以上序列的5'-端均生物素化，探针5^-端标记了地高辛。将cDNA质粒按常规CaC12方法制备JM109 (本室保存）感受态细胞，在氨苄青霉素（50 μg/ml)平板上筛选阳性转化菌。挑取单个克隆，用含氨苄青霉素（50 μg/ ml) 的Luria-Bertani(LB)培养基扩增。采用超纯质粒DNA纯化试剂盒抽提细菌质粒。用荧光法进行定量，根据分子量计算 cDNA的摩尔浓度和拷贝浓度。最终制各成60 fmol/μl标准原液和2×10⁹拷贝/μl标准原液-80℃冻存。

1.3包被微孔板按Xiao LH提供的方法包被微孔板W，每孔加入100μl用磷酸盐缓冲液(PBS) 0.01 mol/ L,pH7.2)稀释浓度为2 mg/ml生物素化的牛血清白蛋白（美国Sizmal公司），4℃过夜。用洗液（含0.05%Tween 20的PBS)洗3次，再加入链亲合素(美国Promega公司）饱和液100μl,37℃温育 1 h。饱和液中含有10 μg/ml链亲合素、0.5%明胶和0.15% Tweeln 20。然后再用洗液洗3次，封装-20℃保存备用。

23~ 26岁，无肿瘤现病史。按要求自每位志愿者采血5~ 7ml。 用NycoPrep^TM 1.077A分离外周血单核细胞80℃冻存。

从非小细胞肺癌H322 细胞中提取总RNA,提取过程按TRIzol试剂说明书操作，并用分光光度法对RNA进行定量，每个样品用1μg的总RNA 进行反转录。PCR反应体系为20μl,反转录产物20μl,10× 扩增缓冲液 5μl,dNTP(5mmol/L)1μl,Mg²⁺ (150mmoVL)1 μl,上下游引物（50mmoVL)1 μl,探针（10 mmol/L)1μl,Taq DNA 聚合酶(Biostar,CANADA)(2U/μ1)1 μl,用无菌蒸馏水补足至20μl。扩增条件如下，首轮循环:变性94℃5min,退火 78℃1min,聚合72℃1.5min;后续循环：变性94℃50s,退火 78℃1min,聚合72℃1.5min;末轮循环：变性94℃50s,退火 78℃1min,聚合 72℃7min。共 35 个循环。

PCR产物5μl与200μl含10nmol/L探针杂交缓冲液混合，94 ℃温育10min后，37℃孵育30min,使之完成杂父反应。取 100μl杂交液加入包被了链亲合素的微孔板，37℃孵育1 h 后，用洗液洗4次。加入100μl含5ng水母发光蛋白由地高辛标记(美国Sigma公司）的分析缓冲液,37℃温育1 h。洗4 次后，在 MicroBeta1450 Liquid Scintillation and Luminescence Counters上，MicroBeta JET按程序自动加入50 μl含钙溶液 (50LmoVL CaCl₂)激发水母发光蛋白发射469 nm的光，仪器记录每秒钟光子数(LCPS)。

取标准原液小量分装，避免反复冻融使DNA降解。通过摸索dNTP、引物、探针、钙离子以及发光蛋白标记物的浓度、扩增条件和杂交条件来优化实验方案,成功地建立了 CKl9-mRNAPCR产物的生物发光分析标准曲线，其线性范围可达5个数量级，最低检测下限为 20amoVL。标准曲线的直线回归系数r= 0.98~ 0 99。

胞中RNA进行PCR扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳图显示各泳道在754bp的位置均有特异性条带出现。非小细胞肺癌H322细胞均能检测到5×10³LmoVL浓度的CK19-mRNA,同时用该法对25例正常人外周血检测，发现有2例检测结果在10¹amol/L数量级，其余23例未检出。检测灵敏度为22amoVL(最低检测限加2倍检测限值标准差)。

发光值LCPS批间变异系数均<7%。将各浓度标准品分5 份同批次检测，其发光值LCPS批内变异系数分别<6%。

目前,检测转移肿瘤外周血CKl9-mRNA常常采用传统的 RT-PCR^{[5, 7]}和 qRT-PCR^{[8, 9]}方法。传统的 RT-PCR 和qRT-PCR方法灵敏度很高，但容易出现假阳性^[4]。传统的比色方法在定量方面不够敏感。其他一些方法如放射自显影和液体闪烁计数只能半定量，且需用放射性核素，因此，这些方法的应用受到限制。近几年己出现多种定量检测PCR 产物的方法，在扩增产物的杂交中应用了荧光标记、化学发光、电化学发光活酶标探针，较传统方法有更高的灵敏度和特异性^{[2, 10]}。

本文建立的CK19-mRNA生物发光分析法和比色分析法在形式上相似，但其有如下优点:具有较高的灵敏度，可达 22amoVL,而比色分析法为fmol/L水平；即使在LCPS值较低时，生物发光分析法的变异系数较小（<6%)。相反，当产物的量很小时，比色分析法的变异系数很> 20%)。此外，与电化学发光法、化学发光法等非放射分析法相比，其操作简便，但灵敏度高于化学发光方法,与电化学发光法的灵敏度相同，而且不需要磁珠。因此,其费用较电化学发光法低。

生物发光分析法的高灵敏度是基于水母发光蛋白的使用，水母发光蛋白是一种含有大量腔肠动物荧光素和分子氧的多肽，在钙离子作用下，由虫荧光素和氧反应生成氧自由基。这一反应会在瞬间产生蓝光，持续时间不足2s,能灵敏地检测这一光谱的仪器易于得到，因此,该方法的灵敏度可大大提高。

PCR产物定量分析方法中,基于水母发光蛋白的生物发光分析是一种简便灵敏的方法,它只需用经济的仪器和非放射性试剂，比传统的方法更灵敏、更经济、更方便，可为mK NA和DNA的定量提供更为灵敏精确的方法。