苯并(a)芘[B(a)P]是第一个被发现的环境化学致癌物，其致癌性很强。但B(a)P是前致癌物，进入体内后在细胞色素P450酶的作用下才能形成终致癌物具有致癌作用。其中反式二氢二醇环氧苯并(a)芘(7,8——dihydrodiol 9，10——epoxide benzo(a)pyrene，BPDE)是B(a)P主要致癌代谢物^{[1, 2]}。BPDE可以与DNA共价结合，还可以与蛋白质及转录因子结合，是细胞突变及恶性转化的早期事件^[3]。目前对BPDE的研究主要限于对BPDE-蛋白加合物及BPDE-DNA加合物的定性和定量分析，而单独对BPDE进行分析的研究较少^{[4, 5]}。为了能够更清楚地研究BPDE的作用机制，建立BPDE的检测方法具有重要意义。本研究根据BPDE的化学性质采用高效液相色谱(HPLC)分析方法对BPDE标准品及在细胞裂解液中加BPDE标准品进行定性分析。紫外吸收检测器应用广泛，灵敏度较高，最小检测浓度可达10-9g／ml^{[4, 5]}。本方法简单、灵敏度高、重现性好，为进一步研究BPDE与生物大分子结合后的定量分析提供了基础依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器

Prostar高效液相色谱仪系列(美国Vrain公司)；超声波破碎仪(美国Sonics公司)。

1.1.2 试剂

甲醇，色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；BPDE标准品(美国国家癌症研究所化学致癌物标准品贮藏室)；二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)；实验用水均为4次蒸馏水。

1.2 HPLC分析条件的确定 1.2.1 储备液的制备

将2.064mg的BPDE标准品溶在DMSO中，定容于10ml容量瓶中，配制成206.4μg／ml的标准品储备液，于-80℃冰箱中避光保存。

1.2.2 细胞裂解液

(1) HepG2细胞接种于250ml培养瓶中，用含10％小牛血清，20万U／ml青霉素和20万U／ml链霉素的DMEM(改良的Eagle培养基)在37℃ 5％CO2的培养箱中培养2 d，收获细胞。(2)用300μl PBS重悬细胞，超声裂解细胞液，超声5s，间歇10s，重复5次。(3) 4℃，10000r／min，离心15min,吸取上层液检测。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18柱(250mm×46mm,10μm，大连依利特分析仪器有限公司)；观察不同的流动相、不同的检测波长及流速对BPDE标准品的影响，确定最佳的分离条件。

1.3 BPDE

标准品高效液相色谱定性分析^{[6, 7]}

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18柱(250mm×46mm，10μm，大连依利特分析仪器有限公司)；流动相：甲醇／水=80／20(V／V)；流速：1.0ml／min；柱温：室温；检测波长：275nm；灵敏度：0.01；进样量：20μl；跑样时间：9min。

1.3.2 BPDE

标准品的标准曲线与检出限分别取1，1.25，5，10，20μg／ml不同浓度的BPDE纯品溶液进行分析，以峰面积Y对其浓度X(μg／ml)作线性回归。以S/N=3信噪比计，测定方法的最低检出限。

1.3.3 精密度

连续5d取BPDE标准品1.25，5.0，20μg／ml，3个低，中，高浓度，每天每个浓度重复测定5次。用相对标准偏差RSD表示精密度。

2 结果 2.1 最优色谱条件的选择 2.1.1 流动相的选择

选用甲醇作为流动相。流动相的配比则比较了以下3种条件下的分离效果，甲醇与水的比例分别为90：10，80：20，70：30。经高效液相检测发现，90：10与70：30这2种配比分离效果均不好，最终选择80：20的配比作为流动相。

2.1.2 流速

流速太慢，组分保留时间长，且峰形不好，峰宽；流速太快，压力过大，有损于色谱柱及仪器寿命，所以选流速1.0ml／min。

2.1.3 最佳吸收波长

选择波长原则有二，一是尽可能选择最大吸收的波长；二是在选定的波长下，色谱峰无明显的重叠和干扰。但在两者矛盾时，需要综合考虑。在参考BPDE标准品的产品说明书，流动相的配比为80：20的条件下，可在360～240nm寻求最佳波长。经HPLC进样分析发现，在相同浓度和相同的进样量时，标准品在λ=275nm时，吸收峰值高，分离情况良好，标准品的DMSO溶液中非待测定成分不干扰测定。

2.2 BPDE标准品的HPLC的工作曲线、检出限及线性范围BPDE

标准品的保留时间在5.2min左右，溶剂的保留时间在3min左右。BPDE标准品在DMSO溶液中的浓度与其峰面积呈现出良好的线性关系，其线性回归方程为Y=637138X-124587，R²=0.9982。对该方程的线性范围进行测试，结果发现BPDE标准品在浓度为1.00～20.00μg／ml范围内具有良好的线性关系，该方法的最低检出限为0.0625μg／ml。

2.3 细胞裂解液中BPDE标准品的HPLC分析

BPDE标准品在细胞裂解液中保留时间在5.7min左右，细胞裂解液的保留时间在2～3min，不对BPDE形成干扰。经不同浓度样品测试，细胞裂解液中BPDE标准品的线性回归方程为Y=424298X+24598，R2=0.9921。

2.4 精密度测试

经5日质量控制测试，本方法的日内精密度RSD为2.9%～3.6%和日间精密度RSD为4.3%～5.9%。

3 讨论

细胞裂解液中BPDE的测试目的是为以后研究B(a)P代谢行为，如定性和定量分析B(a)P经细胞代谢而生成BPDE终致癌物等作基础方法学准备。经多次实验发现，在同样的浓度下，BPDE标准品和细胞裂解液中的BPDE标准品的峰面积出现差异，经过分析，在细胞裂解液中的BPDE的含量偏低，但显著高于在环境中的自然变化。由此推测，BPDE可能与裂解液中的某些生物大分子发生了反应，如形成DNA加合物等^[8]，致使实验所得的数据与预想的结果出现偏差。因此，对细胞中由B(a)P代谢生成的BPDE进行定性定量分析时，应根据不同目的选择不同工作曲线。如果以BPDE标准溶液的工作曲线为参照，则结果显示的是游离BPDE含量；如果以细胞裂解液中BPDE标准品的线性曲线为参照，则结果显示的是游离BPDE和BPDE加合物的总含量。以上研究结果发现，HPLC的紫外检测方法具有良好的分离效果及较高的检出限。但在实际代谢研究中，可能会要求更低的检出限。其解决办法有二，或样品浓缩，或样品酸化处理，以便检出总BPDE，而忽略游离态和加合物之分。