中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (5): 593-595   PDF    
引用本文
蒋玲, 李玲, 吴君, 欧兵, 张韵, 李诚秀, 程明亮, 杨勤. 氧化应激致慢性水砷暴露小鼠肝损伤作用[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(5): 593-595.
JIANG Ling, LI Ling, WU Jun, et al. Effect of oxidative stress in hepatic injury in oral drinking arsenic exposed mice[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(5): 593-595.
氧化应激致慢性水砷暴露小鼠肝损伤作用
蒋玲1, 李玲1, 吴君2, 欧兵2, 张韵2, 李诚秀1, 程明亮2, 杨勤3     
1. 贵阳医学院药理教研室, 贵阳 550004;
2. 贵阳医学院附属医院感染科;
3. 贵阳医学院病理生理教研室
收稿日期: 2007-08-11
基金项目: 国家自然科学基金项目(30471592);科技部国际科技合作与交流专项经费项目〔2005DFA30640(A类)〕
作者简介: 蒋玲(1982- ),女,贵州人,硕士在读,研究方向:药理学。
通讯作者: 吴君
摘要： 目的 比较不同价态的砷对小鼠脐组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(GST-Pi)表达的影响,探讨氧化应激在慢性砷暴露致肝损伤中的作用. 方法 60只雄性昆明种小鼠,体重(20±2)g,随机分为对照组、亚砷酸钠组和砷酸钠组.染毒10个月后处死小鼠,检测血清肝功能;测定肝组织总砷含量;做病理检查;Trizol-酚-氯仿一步法提取小鼠肝组织总RNA,紫外分光光度法测定总RNA浓度及纯度.逆转录PCR(RT-PCR)技术测定小鼠肝组织中GSH-Px和GST-Pi mRNA的表达,以18S基因作为质控. 结果 亚砷酸钠组在肝组织中的砷蓄积量[(3992±250)ng/g组织]高于砷酸钠组[(2603±357)ng/g组织](P<0.05);砷暴露组的肝组织病理检查显示有明显组织损伤;与对照组比较,亚砷酸钠组的血清丙氨酸转氨酶(ALT)[(61.46±13.85)U/L]、天冬氨酸转氨酶(AST)[(510.86±59.01)U/L]、球蛋白(Glb)[(26.94±3.73)g/C)]L值均显著升高,肝组织中GST-Pi mRNA的表达(163.3±11.6)降低,P<0.05. 结论 砷致小鼠肝损伤与砷在肝组织中的蓄积有关.氧化应激可能是慢性饮水砷中毒致小鼠肝损伤的机制之一.
关键词： 饮水砷暴露:肝损伤     谷胱甘肽过氧化物酶     谷胱甘肽-S-转移酶     逆转录PCR    
Effect of oxidative stress in hepatic injury in oral drinking arsenic exposed mice
JIANG Ling, LI Ling, WU Jun, et al     
Department of Pharmacology, Guiyang Medical Colleges Guiyang 550004, China
Abstract: Objective Tocompare the expression and its significance of glutathione peroxidase(GSH-Px)and glu tathione-S-transferase(GST-Pi)in hepatictissue in oral drinking arsenicexposed mice. Methods 60 mice were divided intocontrol group,sodium arsenite group and sodium arsenate group atrandom.The mice were sacrificed after 10 month for the liverfunction,total arsenicdetection and patholog icexamination.Extractthe total RNA of hepatictissue and detectits density and purity,detectthe expression of GSH-Pxand GST-Pi mRNA with real time fluorescence quantitative PCR and the resultwas controlled with 18s. Results Arsenica ccumulation in sodium arsenite group(3 992±250)ng/g tissue was hig herthan thatof sodium arsenite group 2603±357ng/gtissue,P<0.05.Pathologicexaminations showed thatthere were notable livercell necrosis and regeneration.Serum AL T6.46±13.85,U/L.AST(510.86±59.0)I U/L.G1b(26.94±3.73)g/L in sedium arsenite group was higher than thatof the normal group,while the expression of GST-Pi mRNA(163.3±11.6)was lower(P<0.05). Conclusion There were relationship between hepaticinjury and arsenicaccumulation.Oxidative stress may be the one of sig nificanteffects in the process of hepaticinjury caused by oral drinking arsenicexposure in mice.
Key words: oral drinking arsenic exposure     hepatic injure     GSH-Px     GST-Pi     RT-PCR    

砷是一种已知的毒物和人类致癌物，在自然界中广泛存在，但是迄今为止还没有一个被广泛认可并且符合砷生物效应的中毒机制，其中砷引起机体氧化与抗氧化代谢失衡是一重要机制。肝脏是毒物代谢的靶器官，砷可以在肝脏蓄积，严重危害人体健康[1-3]。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(GST-Pi)既是机体的抗氧化酶，也是重要的异物代谢酶，它们可清除代谢产生的氧自由基，从而使机体免受自由基的侵害，保护细胞膜结构和功能的完整性[4]。因此，本研究在建立慢性饮水砷暴露致小鼠肝损伤的模型上，应用RT-PCR技术对饮水砷暴露小鼠肝组织GSH-Px和GST-Pi mRNA的表达进行检测，观察肝脏抗氧化酶系统在基因水平的变化，探讨慢性饮水砷暴露致小鼠肝脏损伤的机制，为砷中毒的防治提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物

昆明种小鼠60只清洁级，雄性，体重(20±2)g，合格证号：SCXK(黔)2002-0001(贵阳医学院实验动物中心)。

1.2 主要试剂

亚砷酸钠(分子式：NaAsO2，分子量为129.9(美国Sigma公司)；砷酸钠(分子式：Na2HAsO4·7H2O，分子量：312，美国Sigma公司)；Trizol试剂(英国Invitrogen公司)；嵌合荧光法(SYBR)Green I荧光染料、随机引物(Oligo dT)、4种脱氧核苷(dNTPs)、RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)、鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV)、PCR引物(根据美国国立生物技术信息中心基因银行中鼠的GSH-Px、GST-Pi、18S cDNA序列进行设计)(均由美国国立卫生研究院癌症/环境卫生研究所刘杰博士惠赠)。

1.3 主要仪器

AB104-N型电子天平(德国Mettler-Toledo Group公司)；TN-100B型托盘式扭力天平(上海第二天平仪器厂)；紫外分光光度仪(德国Mastercycler gradient Eppendorff公司)；5700荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；Ultrospec 2100 pro核酸蛋白分析仪(美国Amersham Biosciences公司)；5810R型台式冷冻离心机(德国 Eppndorf 公司)；AEROSET2000型全自动生化分析仪(美国 Abbott 公司)； AAanalst100型原子吸收光谱图像分析仪(美国 Perkin-Elmer公司)。

1.4 动物模型复制

将60只小鼠随机分成对照组、亚砷酸钠组、砷酸钠组，每组各20只。对照组给予自来水自来水；亚砷酸钠组给予砷溶液(由NaAsO2和双蒸水配成，浓度300mg/L 砷酸钠组给予砷溶液由Na2HAsO4·7H2O和双蒸水配成，浓度300mg/L自由饮用。10个月后采用眼球取血处死小鼠，留取血液及部分肝组织作指标检测。

1.5 血清肝功能指标检测

血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、球蛋白(Glb)由贵阳医学院附属医院生化科采用全自动生化分析仪完成测定。

1.6 肝组织总砷含量测定

取100～150mg肝组织采用原子吸收光谱图像分析法测定组织内总砷含量。

1.7 肝组织病理检测

肝组织石蜡包埋、切片、HE染色由贵阳医学院病理科完成。

1.8 RT-PCR检测 1.8.1 引物

(1)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)GenBank Accession Number：X03920，上游引物5′-CGGGTTCGAGCCCAATTT-3′，下游引物5′-GGGTGTTGGCAAGGCATTC-3′。(2)胎盘型谷胱甘肽-S-转移酶(GST-Pi)GenBank Accession Number：D30687，上游引物5′-TGGGCATCTGAAGCCTTTT-3′，下游引物5′-GATCTGGTCACCCACGATGAA-3′。(3)内参18S GenBank Accession Number：X56974，上游引物5′-CGAACGTCTGCCCTATCAACTT-3′，下游引物5′-CCGGAATCGAACCCTGATT-3′。

1.8.2 总RNA提取

取各组小鼠肝组织各100mg，加入总RNA抽提试剂Trizol 1ml中，用小号玻璃研磨器做肝组织匀浆，运用标准Trizol-酚-氯仿一步法提起小鼠肝组织总RNA并纯化，紫外分光光度法测定总RNA浓度及纯度。

1.8.3 逆转录合成cDNA

逆转录反应体系100μl：包括总RNA 1000ng，25mmol/L MgCl2 22μl，10×PCR Buffe II 10μl，10mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTPs)20μl，10μlmol/L Oligo dT 5μl，20U/μl RNase Inhibitor 2μl，50U/μl MMLV 2.5μl，RNase-free H2O补足体积(18.5μl)循环参数设置：25℃ 10min，48℃60min，95℃ 5min，4℃保存，置-20℃备用。

1.8.4 实时荧光定量PCR法检测mRNA表达

PCR扩增：PCR反应体系为20μl，包括逆转录产物4μl，100μmol/L上、下游引物各0.5μl，2×Buffer SYBR Green 10μl，RNase-free H2O 5μl。PCR扩增条件：预变性94℃ 5min；94℃变性45s，退火55℃60s，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸10min。

1.9 统计分析

采用SPSS 11.5统计软件进行方差分析。

2 结果 2.1 肝组织砷含量测定结果

砷在实验组小鼠肝脏组织中有明显的蓄积效果，2个实验组比较，亚砷酸钠组的蓄积量[(3992±250)ng/g组织]更高，为砷酸钠组〔(2603±357)ng/g组织的1.53倍，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 小鼠肝功能检测结果(表 1)

亚砷酸钠组的ALT、AST、Glb值均明显高于对照组(P<0.05)，分别对照组的1.68，3.78，1.29倍；砷酸钠组仅AST值比对照组显著升高，其余项结果差异无统计学意义。

表 1 小鼠肝功能检测结果（x±s）

2.3 肝组织病理结果(图 1)

对照组小鼠肝脏肉眼可见肝体积正常，无淤血肿大及脂肪变。亚砷酸钠组和砷酸钠组肉眼观察显示肝组织有不同程度肝体积增大，肝表面不光滑，切面呈黄色或红褐色，表明有轻度脂肪变性。镜检结果：对照组见肝小叶结构完整，无变性、坏死、炎性细胞浸润及纤维组织增生；亚砷酸钠组见肝细胞水样变性，脂肪样变性，气球样变性，肝细胞液化坏死，炎细胞浸润，肝细胞再生，汇管区少许纤维增生，纤维条索形成；砷酸钠组见肝细胞水样变性，脂肪样变性，炎细胞浸润，肝细胞再生，但无明显纤维增生表现。

图 1 砷致小鼠肝损伤的病理变化(HE，768×576)

2.4 GSH-Px和GST-Pi mRNA测定结果(表 2)

与对照组比较，亚砷酸钠组仅GST-Pi基因表达的下调差异有统计学意义(P<0.05)；而砷酸钠组的GSH-Px、GST-Pi mRNA表达无明显变化。

表 2 GSH-Px和GST-Pi mRNA结果（x±s）

3 讨论

黄耀辉等发现，砷在肝脏中蓄积浓度最高，且随蓄积量的增高，可引起肝损伤，甚至发展为肝纤维化、肝硬化、肝癌的趋势[5]。本实验结果显示，亚砷酸钠组的砷蓄积量显著大于砷酸钠组，是由于砷酸钠较亚砷酸钠在体内的排泄速度快，三价砷在体内蓄积的趋势更大。砷暴露小鼠肝功指标均高于对照组。病理结果显示，肝细胞有坏死、再生，汇管区少许纤维增生，纤维条索形成，由此可证实2种砷化物均可导致肝损伤，两者比较，前者无论从血清学还是病理损伤程度都大于后者，这可能与三价砷的毒性高于五价砷有关。

研究表明，砷在代谢中可产生各种自由基，导致机体动员抗氧化物来清除自由基，使抗氧化物减少或活性降氐，过量的砷离子还可以直接攻击氧，破坏氧化与抗氧化平衡，发生膜脂质过氧化。黄晓欣等[6]发现，在慢性砷中毒患者体内GSH-Px的活力随着中毒程度的加重而下降，与本实验结果基本一致。GSH-Px是一种含巯基稍对巯基又有很强的亲和力的物质[7],可直接与GsH-Px结合，使后者的活性降低。近年来发现，GST的各亚型可抑制微粒体过氧化反应及修复自由基引起的膜磷脂损伤，提示GST-Pi具有过氧化物酶的活性。另外，砷的甲基化代谢反应的限速酶甲基胂酸还原酶(MMA5+)亦属于GST家族[8]，可促进砷或其代谢产物排除体外，降低毒性。GST-Pi的表达降低提示机体的抗氧化能力及异物代谢能力均有所减弱。

综上所述，砷进入小鼠体内后可能导致机体氧化与抗氧化系统失衡，造成组织氧化应激损伤，表明氧化应激可能是砷中毒致小鼠肝损伤的重要机制。

(致谢：感谢美国国立卫生研究院刘杰老师对本课题的指导。)

参考文献
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