本室研究发现,SO2是一种具有多种毒性作用的全身性毒物[1],吸入SO2或将其衍生物腹腔注射对大鼠均有降压作用[2, 3],SO2衍生物对血管有舒张作用且与内皮细胞无关[4, 5]。最近发现,SO2衍生物作用于血管后,前列环素(PGI2)合成增加,cAMP参与了其细胞内信号转导过程[6]。为了探讨环腺苷酸单磷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)信号转导系统在SO2体内衍生物引起大鼠血管舒张中的作用及内皮在血管舒张中的意义,本实验研究了SO2衍生物引起内皮完整血管和去内皮血管舒张时,血管组织环腺苷酸单磷酸(cAMP)、环鸟苷酸单磷酸(cGMP)、PGI2、血栓素(TXA2)含量及PKA活性的变化。
1 材料与方法 1.1 主要试剂亚硫酸钠(Na2SO3)、亚硫酸氢钠(NaHSO3)、去甲肾上腺素(NE)、乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach),leupeptin,aprotanin,及β-mercaptoethanol(美国Sigma公司);PKA检测kit(美国Promega公司)。[Y-32p]-三磷酸腺苷[-32p]ArrP)(3000Ci/mmol/L)(北京中国同位素公司)。SO2衍生物溶液是Na2SO3和NaHSO3混合液,使用前按二者的摩尔比约为3:1的比例溶于双蒸水中制成。
1.2 血管环的制备取Wistar雄性大鼠,7周龄,体重220~250g(山西中医研究所动物中心)。大鼠胸主动脉血管环的制备及去除内皮均按照本室建立的方法[3]。血管环长约3mm,根据实验需要,采用棉签磨擦血管环内表面的方法,去除内皮,以接受Ach 1.0mol/L刺激而不产生舒张作用为内皮去除干净。
1.3 实验分组SO2衍生物对离体血管环的实验分为内皮完整组和去内皮组2组。各组又分:对照组(生理盐水组)及SO2衍生物不同浓度(2,4,8mmol/L)。每组血管环为9或6个;为了研究鼠间个体差异,每对内皮完整和去内皮的血管环均来自同一只大鼠的胸主动脉。
1.4 血管环张力的检测按照本室建立的方法[2, 3]。首先给予10-6mol/L NE使得血管收缩达坪值,以此坪值作为100%。然后分别向血管环的浴槽中加入SO2衍生物溶液(至所需终浓度)。记录曲线变化,测其舒张幅度。计算血管环的舒张百分率。对照组以生理盐水代替SO2衍生物等容加入。
1.5 血管环cAMP、cGMP、6-keto、TXB2含量及PKA活性测定血管组织匀浆及其上清液的制备均按照本室建立的方法[6],cAMP和cGMP的测定,采用[125I]-cAMP RIA Kit和[125I]-cGMP RIA Kit放免试剂盒(上海中医药大学同位素室),严格按照说明书测定血管组织cAMP和cGMP含量。6-Keto和TXB2的测定,采用6-Keto-PGF1A及TXB2放免测定试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所),按照说明书测定血管组织6-keto和TXB2含量。PKA活性的测定按试剂盒说明书操作。
1.6 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝测定法[7]。
1.7 统计分析采用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差(one way ANOVA)分析。
2 结果 2.1 胸主动脉血管环张力的变化(表 1)从表 1可知,在10-6mol/L NE预收缩后,加入SO2衍生物后血管环张力逐渐减小,表现为舒张作用,且与SO2衍生物的浓度呈剂量依赖性。SO2衍生物对去内皮的血管环同样有舒张作用,与内皮完整时的血管比较差异无统计学意义(P>0.05)。
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表 1 SO2衍生物对大鼠离体血管环的舒张作用( x±s) , ( 舒张百分率, %) |
2.2 血管组织cAMP和cGMP含量(表 2)
表 2表明,正常对照未去内皮血管组cAMP和cGMP含量显著高于去内皮血管组;在SO2衍生物作用下去内皮组cAMP和cGMP含量比未去内皮组含量较低,但差异无统计学意义;SO2衍生物可引起未去内皮和去内皮血管组cAMP含量显著升高,而对cGMP含量未见显著影响;无论是否去除内皮,SO2衍生物均使其cAMP/cGMP比值显著升高。
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表 2 SO2衍生物对血管组织cAMP、cGMP、6-keto、TXB2含量的影响( n= 6, x±s) |
2.3 血管组织6-keto和TXB2含量
表 2表明,SO2衍生物对于去内皮和不去内皮的血管环均可使其6-keto含量显著增加,且二者差异无统计学意义,表明SO2衍生物引起的6-keto含量增加与内皮无关;SO2衍生物对血管环TXB2含量无影响。
2.4 血管组织中的PKA活性(表 3)表 3表明,正常对照未去内皮血管组PKA活性显著高于去内皮血管组,血管内皮与PKA酶有关。SO2衍生物对去内皮和不去内皮的血管环均可使PKA活性增高,且二者差异无统计学意义。但SO2衍生物在高浓度下(8mmol/L),血管环无论是否去内皮其PKA活性均无明显变化。
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表 3 SO2衍生物对血管组织PKA活性的影响( n= 6, x±s) |
3 讨论
近年来,我们报道了,SO2及其衍生物可引起大鼠尾动脉血压显著下降[2, 3],SO2衍生物对大鼠离体动脉血管环有舒张作用[4, 5],同时PGI2-AC-cAMP信号通路上调[6]。本研究结果表明,SO2衍生物对未去内皮和去内皮的血管同样产生舒张作用,提示外源SO2衍生物的舒张血管作用不需要血管内皮细胞的介导,为非内皮依赖性舒张作用与我们以前的报道一致[2, 3]。从表 2可知,SO2衍生物无论对未去内皮血管环还是对去内皮血管环均能剂量依赖性地显著增高cAMP和6-keto含量,而对cGMP含量有降低趋势,对TXB2含量则无显著性影响。结果进一步证实了SO2衍生物在对血管的舒张作用中,PGI2和cAMP参与了其细胞内信号转导过程[5]。
PKA在信息调控及细胞功能调节中占有十分重要的地位。PKA的活化主要受胞内cAMP浓度的影响。本实验结果表明,SO2衍生物不论对不去内皮组还是去内皮组,均能显著提高血管环中PKA活性,且未去内皮组与去内皮组之间差异无统计学意义,说明PGI2-AC-cAMP-PKA信号转导通路是SO2衍生物引起血管舒张的重要信号通路之一,且SO2衍生物可直接活化此通路,是非依赖血管内皮的。本室以前的研究发现,高浓度外源SO2衍生物可抑制血管平滑肌细胞膜电压依赖性钙通道(PDC)和受体依赖性钙通道(ROC),同时对该细胞的内钙释放也有抑制作用[5]。本研究推测,高浓度外源SO2及其衍生物作用于大鼠胸主动脉血管,激活PKA并使某些相关底物磷酸化,使组成血管平滑肌细胞Ca2++和K+离子通道的蛋白质分子发生改变,抑制平滑肌细胞外钙内流,同样使组成胞内钙库膜的蛋白质分子发生改变,抑制内钙释放,从而导致血管舒张。
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