中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (5): 536-538   PDF    
引用本文
李希波, 孙雪飞, 尹秋伟, 王善政. 肺癌患者K-ras、FHIT基因异常与吸烟关系[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(5): 536-538.
LI Xi-bo, SUN Xue-fei, YIN Qiu-wei, et al. Correlation analysis between abnormality of K-ras gene and FHIT gene with smoking in lung cancer tissue[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(5): 536-538.
肺癌患者K-ras、FHIT基因异常与吸烟关系
李希波, 孙雪飞, 尹秋伟, 王善政     
山东大学齐鲁医院胸外科, 济南250012
收稿日期: 2007-08-13
作者简介: 李希波(1963- ),男,山东武城人,副教授,博士,硕士生导师,研究方向:肺癌的基础研究。
通讯作者: 王善政
摘要： 目的 探讨吸烟与肺癌患者原癌基因K-ras点突变和人类脆性组氨酸三联体(FHIT)基因转录异常的关系,探讨吸烟致肺癌作用靶点. 方法 应用PCR-RFLP和RT-PCR分别检测80例肺癌患者及20例正常肺组织中K-ras、FHIT基因的异常情况,分析吸烟与K-ras、FHIT基因异常的关系. 结果 肺癌组织K-ras基因突变率为52.58%,FHIT基因转录异常阳性率为71.25%,与正常肺组织比较差异均有统计学意义(P<0.05).肺癌组吸烟者的K-ras、FHIT基因异常率高于不吸烟者(P<0.05).K-ras、FHIT基因异常与吸烟指数相关联,列联系数P分别为0.337和0.399;吸烟与肺腺癌K-ras基因点突变、肺鳞癌和小细胞肺癌的FHIT基因异常转录关系密切(P<0.05).肺癌患者K-ras突变与FHIT转录异常无明显关联性,但两者在肺癌组织中差异有统计学意义(P<0.01). 结论 K-ras、FHIT基因异常与肺癌发生密切相关.吸烟是肺腺癌中K-ras基因点突变和肺鳞癌、小细胞肺癌中FHIF基因异常转录的一个重要因素.
关键词： 肺癌     原癌基因K-ras     人类脆性组氨酸三联体基因     吸烟    
Correlation analysis between abnormality of K-ras gene and FHIT gene with smoking in lung cancer tissue
LI Xi-bo, SUN Xue-fei, YIN Qiu-wei, et al     
Department of Thoracic, Qilu Hospital, Shandong University Ji'nan 250012, China
Abstract: Objective To study the relationship between the abnormal of proto-oncogene K-ras gene and Fragile His tidine Triad(FHIT)gene with cigarette smokingin lung cancertissue.To reveal the target of smoking in lung cancer. Methods Polyanerase chain reaction plus restriction fragment length polymorphism(PCR-RFL P)were used to detect the mutation of K-ras gene and reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)method was used to detect the abnormal transcription of FHIT gene in 80 cases lung cancer tissue and 20 cases of nor mal control lung tissue.A nalyze the relationship between cigarette smo king with K-ras mutation and the abnormal transcription of FHIT gene. Results K-ras mutation rate in lung cancer tissue was 52.58%.The abnormal transcription rate of FHIT gene was 71.25%.Statistical significant difference was found compared to normal control lung tissue.K-ras mutation rate and FHIT gene abnormal transcription rate of cigarette smoking group was higher than that of no smoking groups in lung cancer patients(P<0 05).BI of lung cancer patient was related to K-ras mutation and FHIT gene abnormal transcription.Pearson coefficient of continency is 0.337 and 0.399 respective.K-ras gene mutation had close correlatetion with cigarette smoking in lung adenocar cinoma.FHIT gene abnormal transcription had close correlatetion with cigarette smo king in lung squamous cell carcinoma and small cell lung cancer.Nor elevance was found between K-ras mutation rate and FHIT geneabnormal transcription rate in lung cancer,but significant difference was found between them. Conclusion The mutation of K-ras gene and the abnormal transcription of FHIT gene have close cor relatetion with tumor igenic development of lung cancer.K-ras and FHIT became the moleculetar get of smoke cancerigenic.Cigarette smoking is an important factor that causes K-ras gene mutation in lung adenocarcinoma and FHIT gene abnormal transcription in lung squamous cell carcino ma and small cell lung cancer.
Key words: lung cancer     K-ras gene     FHIT gene     smoking    

吸烟是肺癌发生的重要危险因素[1]，吸烟者肺癌的发病率是不吸烟者的十几倍[2]。肺癌的发病率与烟草消耗量有明显的相关性，但至今烟草诱发肺癌的机制、作用靶点及关键步骤仍未能阐明。本研究通过检测与易受环境因素影响肿瘤原癌基因K-ras基因和抑癌基因人类脆性组氨酸三联体(FHIT)基因，分析肺癌患者K-ras基因点突变和FHIT基因转录异常与吸烟关系，从基因水平探讨吸烟诱发肺癌的可能机制及作用靶点，以便寻找更有效的防治手段，为肺癌的预防及早期诊断、早期治疗提供依据。

1 对象与方法 1.1 对象

随机选取山东大学齐鲁医院胸外科2004年1月～2005年12月手术治疗的肺癌患者80例。全部患者术前均未经任何化疗和放疗，且术后经病理检查证实诊断；随机选取20例同期术中采集的正常肺组织标本作为正常对照组。

1.2 方法 1.2.1 标准采集

对每位患者的吸烟情况及临床病理特征均进行详细记录。标本采集于术中，分别切取肺癌组织及不在同一肺叶的正常边缘肺组织各1小块，液氮内速冻，-80℃深低温冰箱保存。

1.2.2 K-ras基因突变的检测 1.2.2.1 DNA抽提及模板制备

取冷冻新鲜组织25g，研碎后用生理盐水(NS）洗涤后，加入细胞裂解液300l，加入50～100l核糖核酸酶A混匀，37℃1～2h加入蛋白酶K100g管，56℃2h以上；酚、氯仿各抽提一遍；加入1/2体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的无水乙醇混匀20℃1h以上。15000r/min离心10min，沉淀加无水乙醇洗一遍，取DNA产物电泳鉴定观察DNA完整性。

1.2.2.2 PCR扩增目标片断

扩增引物由上海博亚生物工程公司合成，按参考文献[3]K-ras基因的引物序列设计如下：P1上游引物：5'-CATGTTCTAATATAGTCACA-3'；P2下游引物：5'-CAAGGCACTCTTTGCCTACGGC-3'。取每10～20l/DNA产物作为模板，反应体系为10×buffer 5l，MgCl23l,核苷三磷酸1l，基因引物P1和P2各50mol/Ll，Taq 2l，DNA10l，无菌去离子水DDW39l，ddH2O定容至50l，封以石蜡油50l。扩增条件为：94℃预变性5min，循环程序：94℃变性30s，52℃退火1min，68℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸7min。取扩增产物电泳，观察110bp目标条带，以证实扩增成功。

1.2.2.3 限制性片断长度多态性分析(RFLP)

检测K-ras基因第12位密码子点突变取PCR产物20l，加入buffer 3l，BanI酶20U/2l混匀后煮37℃恒温水浴酶切过夜。取10l酶切产物与2l缓冲液混匀加入加样孔聚丙烯酰胺电泳。

1.2.2.4 实验结果判定

由于野生型K-ras基因第一外显子第12密码子存在着酶切位点，经限制性内切酶酶切后，成为89和21bp2个片断，电泳表现为2个条带，而突变型K-ras基因序列中丧失BanI酶切位点，无法切成2个条带，酶切电泳后仍为110bp1个条带。

1.2.3 FHIT基因转录异常的检测 1.2.3.1 总RNA提取

取每份标本的冷冻新鲜组织100mg，移入组织匀浆器中，加入异硫青硫胍(GIT)变性液600l匀浆后吸取500l至Eppedorf管中，按说明书经氯仿抽提，异丙醇离心沉淀出总RNA溶于去离子水中，测量吸光度(A)值，即可直接用于RT-PCR或于-80℃保存备用。

1.2.3.2 FHIT基因引物设计与合成

引物均由上海博亚生物工程公司合成，根据Genebank Database提供的FHIT基因全长cDNA序列，引物设计如下：外引物：Exonl-10;5U2(F) 5'-CATCCTGGAAGCTTTGAAGCTCA-3'；3D2(R) 5'-TCACTGGTTGAAGAAGAATACAGG-3'。内引物：Exon3-10；5U1(F) 5'-TCCGTAGTGCTATCTACAT-3；3D1(F)5'-CATGCTGATTCAGTTCCTCTTGG-3'。

1.2.3.3 FHIT基因cDNA的合成及电泳鉴定(RT-PCR)

取组织总RNA提取物1g加入经焦碳酸乙二酯(DEPC)处理的0.5ml Eppedorf管中，再依次加入以下试剂：反转录酶1l，逆转录反应体系7l，下游引物3D2 1l，去Rnase水补至20l。离心混匀37℃1h，95℃10min灭活反转录酶，快速离心使蒸气沉于管底。在以上RT产物20l的0.5ml Eppedorf管中加入以下试剂构成PCR体系：10×buffer 10l、MgCl2 6l、dNTP 2l、上游引物5U2 1l、Taq2.5U/0.5l、超纯水60.5l。快速离心混匀；95℃5min，冰浴冷却，然后快速离心使蒸气沉于管底，加入2l TaqDNA聚合酶，快速离心混匀，加入60l液体石蜡。循环条件为94℃1min,58℃1min，72℃1min，共30个循环，72℃延长7min。将扩增产物稀释20倍，取4l进行第2轮PCR，引物为5U1和3D1，反应体系同第1轮PCR。取10l第2轮PCR产物进行电泳并溴化乙锭（EB）染色拍照。

1.2.3.4 FHIT基因转录异常的判断

正常FHIT基因转录本长约700bp，电泳结果显示700bp1个条带，当FHIT基因缺失时，电泳可见多个大小不等的RNA转录本条带，多集中在400～250bp附近，当FHIT基因纯合性缺失时，标本无任何转录本扩增处，电泳图缺乏上述各种条带。

1.3 统计分析

应用SAS 6.0统计软件进行x2检验。

2 结果 2.1 基本情况

肺癌患者共计80例，男58例，女22例；年龄33～74岁。病理类型：鳞癌(SCC)41例，腺癌(ACC)29例，小细胞肺癌(SCLC)6例，大细胞肺癌(LCLC)4例；TNM分期（按MICC1997年标准)I期19例，II期33例，III期26例，IV期2例。有吸烟史54例，吸烟指数(BI=每天吸烟支数×吸烟年数)为110～950，平均为465。不吸烟患者为从未吸烟，不包括曾吸烟已忌烟者。

2.2 肺癌与肺正常组织K-ras、FHIT基因异常的比较

80例肺癌标本中42例存在K-ras基因12密码子点突变(图 1)，突变率为52.58％，57例标本存在FHIT基因转录异常(图 2)，缺失率为71.25％，而正常肺组织未见K-ras基因点突变和FHIT基因转录异常，2组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。

注：pUC19DNA+/MspI(HpaII)Marker;1：突变型K-ras丧失酶切点为110bp条带；2：野生型K-ras存在酶切位点，被切成21和89bp片断，显示为2个条带。 图 1 K- ras 基因电泳图

注：GeneRuler 1kb DNA marker;1：正常FHIT基因转录本700bp条带；2，3，4：FHIF基因异常转录本为大小不等的片断，多位于400～250bp之间，其中3仍可见700bp左右的正常条带及其他异常条带。 图 2 FHIT基因电泳图

2.3 吸烟对肺癌患者K-ras、FHIT基因异常的影响(表 1，2)

吸烟组肺癌患者的K-ras基因点突变率、FHIT基因异常转录率明显高于不吸烟组，2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。进一步分析吸烟组患者吸烟指数(BI)与K-ras基因点突变、FHIT基因异常转录的关系，列联表x2检验显示肺癌患者K-ras基因突变、FHIT基因异常转录与BI相关联，Pearson列联系数(P)分别为0.337和0.399；两两比较显示，不同BI组之间的K-ras基因点突变率比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，而FHIT基因异常转录率则在BI>200时即明显升高(P＜0.05)，高达90.48％。

表 1 吸烟与肺癌患者K-ras基因突变、FHIT基因异常转录关系

表 2 肺癌患者吸烟指数与K-ras基因突变、FHIT基因异常转录关系

2.4 吸烟对不同型肺癌患者K-ras、FHIT异常的影响(表 3)

分层分析不同肺癌病理类型吸烟与K-ras基因点突变、FHIT基因异常转录的关系。结果显示，肺腺癌中吸烟与K-ras基因点突变关系密切，而肺鳞癌和小细胞肺癌中吸烟与FHIT基因异常转录的关系密切，差异均有统计学意义(P＜0.01)。

表 3 吸烟对不同病理类型肺癌患者K-ras、FHIT基因异常的影响

3 讨论

多种肿瘤存在癌基因Ras的突变和激活，常见于肺癌、结肠癌和胰腺癌。Ras家族包括H-ras、N-ras和K-ras3个成员，而K-ras与肺癌关系最密切[4]。本研究显示，肺癌患者存在较高的K-ras点突变和FHIT转录异常阳性率，而正常肺组织中未见两者之间异常，表明K-ras点突变和FHIT转录异常与肺癌的发生关系密切。6例SCLC组织中无一例K-ras点突变，与Wistuba8的研究结果相同，但有5例FHIT转录异常，表明K-ras点突变与NSCLC发生密切相关，而SCLC的发生与FHIT异常转录的关系更为密切。肺癌组吸烟者K-ras点突变和FHIT转录异常率明显高于不吸烟患者(P＜0.05)，并且2个基因异常与患者吸烟指数均呈正相关，提示K-ras和FHIT基因可能为烟草致肺癌的分子靶点，K-ras点突变和FHIT转录异常可能为烟草致肺癌的关键步骤。按病理类型分层分析结果表明，吸烟是肺腺癌和大细胞癌患者K-ras突变的重要因素。而对于肺鳞癌和小细胞肺癌患者，吸烟是其FHIT转录异常的重要因素，进一步证实两者是吸烟致肺癌的作用靶点。但本研究2个基因异常无明显关联性，且其异常变化存在差异，说明烟草可经过不同的靶点导致肺癌的发生发展，靶点不同对其最终致癌的病理类型存在影响，是否与烟草中的不同致癌物分别有不同的作用靶点有关，仍有待进一步研究。

参考文献
[1] Tyczynski JE, Bray F, Parkin DM. Lung cancer in Europein 2000: epidemiology, prevent ion, and early det ect ion[J]. Lancet Oncol, 2003(1) : 45–55.
[2] Williams MD, Sandler AB. The epidemiology of lung can cer[J]. Cancer T reat Res, 2001, 105 : 31–52. DOI:10.1007/978-1-4615-1589-0
[3] Sagawa M, Saito Y, Fujumura S, et al. K-ras poit mut at ion occurs in the early stage of cancinogenesis in lung cancer[J]. Br J of Can?? cer, 1998, 77(5) : 720–723.
[4] Minamoto T, Mai M, Ronai Z. K-ras mutation: early detection in mol ecular diagnosis and risk assessm ent of colorect al, pancreas, and lung cancers-a review[J]. Cancer-Det ect-Prev, 2000, 24(1) : 1–12.
[5] Wistuba IJ, Gazdar AF, Minna JD. Molecular genetics of small cell lung carcinoma[J]. Semin Oncol, 2001, 28(2 Supply) : 3–13.