中国公共卫生  2008, Vol. 24 Issue (3): 373-374   PDF    
引用本文
陈敏, 朴丰源, 孙鲜策, 李秋娟, 杨光, 叶建新, 曲淑贤, 刘晓芳. 8-硝基鸟嘌呤在砷暴露小鼠心肌细胞中表达[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(3): 373-374.
CHEN Min, PIAO Feng-yuan, SUN Xian-ce, et al. Expression of 8-nitroguanine in cardiac muscle cell exposed to arsenic[J]. Chinese Journal of Public Health, 2008, 24(3): 373-374.
8-硝基鸟嘌呤在砷暴露小鼠心肌细胞中表达
陈敏, 朴丰源, 孙鲜策, 李秋娟, 杨光, 叶建新, 曲淑贤, 刘晓芳     
大连医科大学预防医学系, 大连 116027
收稿日期: 2007-06-15
基金项目: 国家自然科学基金(30571584,30600488);辽宁省教育厅基金项目(05L113)
作者简介: 陈敏(1959- ),女,辽宁大连人,副教授,学士,研究方向:营养与食品卫生学。
通讯作者: 朴丰源
摘要： 目的 通过检测活性氮族引起的核酸损伤标志物8-硝基鸟嘌呤(8-NO2-G)在砷暴露小鼠心肌组织中的表达情况,探讨砷对心肌细胞的毒性作用机制。 方法 昆明种小鼠40只,随机分为4组:1,2,4mg/L三氧化二砷染毒组和生理盐水组。连续染毒60d,取小鼠心脏组织固定,用免疫组化方法观察心肌细胞的8-NO2-G表达。 结果 对照组小鼠心肌细胞中无8-NO2-G表达,而砷暴露组小鼠心肌细胞的胞浆被染成棕褐色,呈现抗8-NO2-G阳性反应,4mg/L剂量染砷组小鼠心肌细胞中8-NO2-G表达明显。 结论 慢性砷暴露可诱发小鼠心肌细胞8-NO2-G的高表达,提示8-NO2-G可能是砷致心肌细胞损伤的早期生物标志物。
关键词： 三氧化二砷     心肌     8-硝基鸟嘌呤     免疫组化     核酸损伤    
Expression of 8-nitroguanine in cardiac muscle cell exposed to arsenic
CHEN Min, PIAO Feng-yuan, SUN Xian-ce, et al     
Hygiene Department, Colleges of Basic Medical Sciences, Dalian Medical University, Dalian 116027, China
Abstract: Objective To explore the molecular mechanism of arsenic toxicology to cardiac muscle cell by detecting the expression of 8-nitro guanine,which was the biochemical marker of nuclear acid damage induced by reactive nitrogen species (RNS). Methods Different concentrations of trioxide arsenic(As2O3)were administered to mice for consecutive 60 days, followed by decollation.Pathologic changes of cardiac muscle cell were detected by HE color ation.Immunohistochemistry method was used to investigate 8-nitrog uanine(8-NO2-G)expression in cardiac muscle cell of mice. Results Pathologic changes were observed in 1,2 and 4ppm groups.The expression of 8-NO2-Gincreased significantly in experimental groups and was in a dose-effect relation(P＜0.05). Conclusion The low dose exposure of mice to arsenic RNSmay result in high expression of 8-NO2-G.It indicated that the 8-NO2-G may be the early bio-marker of cardiac muscle cell damage induced by arsenic.
Key words: arsenic     cardiac muscle     8-nitroguanine     immuno histochemistry     nuclear acid damage    

砷进入机体后，通过循环系统分布到全身各个器官和组织，故对循环系统会造成损伤。临床上可出现与心肌损伤相关的异常表现，如心电图异常、局部微循环障碍、心脑血管疾病等[1]。但是，砷的毒作用机制还不十分清楚。目前认为，砷作用后可引起细胞内超氧阴离子自由基（·O2-）、羟自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2）等活性氧族（ROS）增多，造成组织细胞的DNA氧化性损伤是砷的毒性作用重要机制之一。近年来的研究表明，砷通过激活细胞质内一氧化氮合酶（NOS）活性，促使过多的一氧化氮（NO）、过氧亚硝基阴离子(ONOO－)等活性氮族（RNS）生成，导致组织细胞损伤。结果提示，RNS参与了砷的毒性作用。8-硝基鸟嘌呤（8-Nitroguanine）是由活性氮族攻击核酸的产物,可进一步导致突变、癌变等发生。本研究以8-Nitroguanine作为砷对心肌细胞毒性作用的生物标志物，通过免疫组化方法，观察砷对小鼠心肌细胞核酸的损伤作用，为探讨砷对心脏的毒性作用机制提供依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器

主要试剂：As2O3（美国Sigma公司）；抗8-NO2-G单克隆抗体（德国Bremen公司）；UltraSensitiveTM S-P 超敏试剂盒二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；其他试剂均为分析纯；主要仪器：YD-1508B石蜡切片机（浙江省金华市益迪医疗设备厂）；BX-51万用光学显微镜（日本Olympus公司）；DC290数码相机（日本Kodak公司）；分析处理系统（Image-pro plus 4.5）。

1.2 实验动物及分组

成熟健康昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重（20±2）mg（大连医科大学实验动物中心）。按体重随机分为4组：1，2，4mg/L的三氧化二砷(As2O3) 染毒组和生理盐水对照组。小鼠通过自由饮用含As2O3自来水方式染毒，每天测水消耗量。连续染毒60d，断头处死并立即取心脏固定。

1.3 心肌细胞的组织形态学观察

经福尔马林固定后，常规石蜡包埋，5μm连续切片，在65℃ 温箱中烤片60min；苏木素-伊红（HE）染色，光镜下进行组织形态学观察。

1.4 心肌细胞的免疫组织化学观察

按照S-P免疫组化染色法[2]，在心脏切片上滴 1:300稀释的鼠抗人8-Nitroguanine单克隆抗体，在 4℃条件下孵育过夜，然后按UltraSensitiveTM S-P超敏试剂盒的步骤进行DAB显色，苏木素复染细胞核，自来水冲洗返蓝。常规脱水、透明，中性树胶封片。阅片时,先观察整张切片,再随机选择不同区域的5个高倍视野,显微镜下拍照，并应用图象分析软件对8-Nitroguanine表达的平均吸光度进行定量分析（Image-pro plus 4.5）。

2 结果 2.1 心肌细胞的病理学观察（图 1）

如图 1所示，对照组心肌细胞核完整，胞浆正常。而染砷组心肌细胞则出现心肌细胞核肿胀、部分核质溶解等病理改变。

图 1 小鼠心肌细胞HE 染色结果 （×200）

2.2 心肌细胞核酸损伤的免疫组织化学观察（图 2）

如图 2所示，对照组小鼠心肌细胞中无8-Nitroguanine表达。而4mg/L剂量染砷组小鼠心肌细胞的胞浆被染成棕褐色，呈现明显的抗8-Nitroguanine阳性反应，2mg/L剂量染砷组小鼠心肌细胞中免疫组化染色较浅，有轻度的8-Nitroguanine表达。

图 2 小鼠心肌细胞抗8-Nitroguanine组织化学染色结果 （×200）

3 讨论

据文献报道，地方性砷中毒患者有心悸、窦性心律不齐、室性早搏，低年龄组出现高比例的心肌缺血等临床表现[3]。急性砷中毒患者出现心肌酶谱的异常变化[4]，认为心肌损伤的机制是与生物膜损伤有关，砷导致心肌细胞溶酶体膜破坏，使细胞发生不可逆损伤、最终导致细胞破坏崩解。近年来，人们开始关注活性氮族（reactive nitrogen species,RNS）在砷所致毒性中所发挥的作用。Chattopadhyay报道人胚和新生大鼠染砷后，显微镜观察发现组织细胞产生较多的NO和脂质过氧化物,说明砷能诱导NO和ROS过度产生[5, 6]。ROS和NO之间涉及许多信号传导通路，它们之间也存在着协同作用。高浓度的NO可以与氧自由基等反应而生成过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-)等RNS[7]。ONOO-能转变为反式结构,发挥氧化应激的作用,影响细胞代谢,使DNA/RNA链断裂,启动脂质过氧化,导致组织损伤。

8-Nitroguanine 是由活性氮族，过氧亚硝酸阴离子或二氧化氮攻击核酸的产物,可进一步导致突变、癌变的发生。本实验结果显示，在慢性砷暴露小鼠心肌细胞中出现8-Nitroguanine的高表达和病理变化，并随着砷暴露剂量的增加而呈现明显的剂量反应关系，说明砷暴露所导致的心肌细胞的核酸损伤与砷的心脏毒性作用有关。同时也提示，8-Nitroguanine可能是砷致心肌细胞损伤的早期敏感生物标志物。

参考文献
[1] 金银龙, 粱超轲, 何公理, 等. 中国地方性砷中毒分布调查[J]. 卫生研究, 2003, 32(6) : 519–540.
[2] Chaudburi AN, Basu S, Chattopadhyay S, et al. Effect of high arsenic content in drinking water on rat brain[J]. Indian J Biochem in Biophys, 1999, 36 : 51–54.
[3] 谢惠芳. 砷对人体作用的多样性[J]. 国外医学卫生学分册, 2001, 285 : 265–269.
[4] 朱世银, 郭春明, 刘玲, 等. 砷中毒患者心肌酶谱的动态变化[J]. 解放军医学高等专科学校学报, 1999, 27(540) : 24–25.
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[6] Chattopadhyay. Arsenic induced changes in growth development and apoptosis in neonatal and adult cells in vivo and tissue culture[J]. Toxicol Lett, 2002, 128 : 73–84. DOI:10.1016/S0378-4274(01)00535-5
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