哮喘是近年来引起广泛关注的慢性呼吸系统疾病，目前世界上大约有1.5亿人遭受哮喘的折磨^[1]。研究表明，大气污染物二氧化硫(SO₂)与哮喘有关，低浓度SO₂可增加哮喘病人的易感性^{[2, 3]}。黏蛋白(mucin,MUC)5AC(MUC5AC)和白介素-13(IL-13)基因表达与哮喘发病密切相关^{[4, 5]}。SO₂及其衍生物能引起小鼠机体DNA损伤和氧化应激^{[6, 7]}，且SO₂能引起大鼠肺组织凋亡基因、原癌基因和某些代谢酶基因表达的改变^{[8, 9]}。本研究采用来源于人支气管上皮的永生化细胞系(BEP2D)，应用荧光实时定量PT-PCR、免疫细胞化学和酶联免疫吸附法(ELISA)等技术，测定经SO₂衍生物处理后BEP2D细胞中MUC5AC和IL-13 mRNA和蛋白水平的变化，为从细胞和分子水平探索哮喘的发病机制，阐明SO₂污染与哮喘之间的关系提供依据。

亚硫酸钠(Na₂SO₃)、亚硫酸氢钠(NaHSO₃)(美国Sigma公司)；LHC-8无血清培养液(美国Biofluids INC公司)；TRIzol(美国Invitrogen公司)。

BEP2D细胞(军事医学科学院二所)，用LHC-8(Laboratony of humar Carcinogenesis-8无血清培养基)在培养箱(3111型，美国Thermo公司)内孵育(95%相对湿度、5% CO₂及37℃)。

选择生长到指数生长期的细胞用于实验，用0，0.000 1，0.001，0.01，0.1，1 mmol/L的SO₂衍生物(Na2SO3和NaHSO3混合液，M/M=3:1)分别处理细胞4 h后，收集细胞和培养上清进行剂量效应研究；同时，用0.1 mmol/L SO₂衍生物处理细胞4 h后，更换新鲜LHC-8培养基，分别在0，0.5，1，4，24 h后收获细胞进行恢复时间效应研究。

采用TRIzol试剂，参照说明书提取各组BEP2D细胞的总RNA。取2 μg的RNA采用禽白血病病毒(AMV)反转录体系合成cDNA。然后以cDNA进行PCR扩增。PCR反应体积为20 μl，其中含1 μl cDNA、2 μl PCR buffer、3.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、上下游引物各0.5 μmol/L、探针0.2 μmol/L及1 U Taq DNA聚合酶。所用引物和TaqMan探针如下：MUC5AC(AF015521)：上游：5′-GTGCCGCCTACGAGGATTTT-3′，下游：5′-ACCACGCCATCCACCTTCA-3′，TaqMan探针5′-FAM-CTACGCCGCAGCCAGGAGTCAGC-TAMRA-3′；IL-13(NM-02188)上游：5′-GTAGGCGGGAAGGAGGGTTAGG-3′，下游：5′-TAGGGCAGGGGAGGGGTGTAG-3′，TaqMan探针5′-FAM-ACATGTCATCCCTGGGTCCACCGA-TAMRA-3′；GAP DH(NM-002046)上游：5′-GGAAGGACTCATGACCACAGT-3′，下游：5′GCCATCACGCCACAGTTTC-3′，TaqMan探针5′-FAM-TGCCATCACTGCCACCCAGAAGAC-TAMRA-3′。反应在Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪上进行。MUC5AC、IL-13和GAPDH的退火温度分别为55，63，56℃；扩增片段长度分别为97，191和85 bp，所有PCR扩增片段大小均经溴化乙啶染色的琼脂糖胶显影所证实。梯度稀释cDNA用做标准曲线，定量分析采用Rotor-Gene 3000 6.0软件，结果以目的基因与GAPDH基因表达的比值表示。

用10%中性福尔马林缓冲液固定细胞，做细胞涂片。采用两步法，高压抗原热修复后，按试剂盒说明书进行免疫细胞化学实验［9901试剂盒和二氨基联苯氨(DAB)显色试剂，福州迈新公司］。一抗为小鼠抗MUC5AC的单克隆抗体(45M1，美国Neomarkers公司，1:200)。用已知阳性片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。光镜400倍下对每组3个独立样本随机取5个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞率。胞浆呈棕色者为MUC5AC阳性表达细胞。

采用ELISA法测定细胞培养液中IL-13水平，按试剂盒(美国R&D公司)说明书进行操作，样品在酶标仪上测定(Model 550，美国Bio-Rad公司)。

采用SPSS 11.0软件进行One-way ANOVA检验。

将对照组标准化为1,各组数值为与对照组的比值作为相对平均表达的倍数。在SO₂衍生物的作用下，除在较低剂量下MUC5AC mRNA表达差异无统计学意义外 ，BEP2D细胞MUC5AC和IL-13的mRNA表达在所测浓度范围内均比对照组显著上升，MUC5AC增幅为2.4～3.9倍；IL-13幅度为2.1～4.7倍。0.1 mmol/L处理4 h后，换上LHC-8培养基，在不同的恢复时间里MUC5AC和IL-13 mRNA水平都显著增高，且都在4 h上升到最高值(25倍和41倍)；之后在24 h有所下降，但与4 h组比较差异无统计学意义。

表 1

表 1 SO2衍生物对人BEP2D细胞MUC5AC和IL-13 mRNA的影响(x±s)

表 1 SO2衍生物对人BEP2D细胞MUC5AC和IL-13 mRNA的影响(x±s)

表 2可见，对照组细胞中MUC5AC阳性细胞很少［(2.67±0.58)%］，SO₂衍生物处理后MUC5AC阳性细胞数显著增加(4.33%～15.33%)。恢复实验也表明，4 h时阳性细胞数量多［(36.67±4.16)%］。不加一抗的阴性对照无特异性染色。

表 2

表 2 SO2衍生物对BEP2D细胞MUC5AC蛋白表达的影响(x±s)

表 2 SO2衍生物对BEP2D细胞MUC5AC蛋白表达的影响(x±s)

表 3可见，在所测浓度范围内及恢复时间内BEP2D细胞培养液中IL-13的水平均分别比各自对照组显著升高，且恢复时间效应是在4 h出现最高值。虽然恢复24 h的数值比4 h的值有所降低，但与之比较差异有统计学意义；其值与对照组比较显著增高。

表 3

表 3 SO2衍生物对BEP2D细胞上清液IL-13水平的影响(x±s)

表 3 SO2衍生物对BEP2D细胞上清液IL-13水平的影响(x±s)

支气管上皮细胞是机体防御外来刺激进入的第一道屏障，并通过分泌黏液和释放炎性细胞因子发挥其生物学效应，与哮喘的发病有联系^{[4, 5, 10]}。MUC5AC是呼吸道上皮细胞特有的分泌黏蛋白的基因^[4]，黏蛋白对正常呼吸系统有重要的保护功能，然而，黏液过度分泌可使黏液层增厚、变稠，纤毛活动受阻，使上呼吸道排出有害物质的能力减弱，诱发各种呼吸道炎症，引发哮喘等慢性呼吸系统疾病^[11]。IL-13是一种细胞因子，在哮喘的发病机制中有重要作用。有研究表明，哮喘患者支气管黏膜和痰液中IL-13的基因mRNA表达上调^[12]，且外来刺激物会引起支气管上皮细胞IL-13的基因表达显著增加^[13]。IL-13作用于支气管上皮细胞可以引起气道高反应性、黏液分泌增多、炎性细胞浸润、促进IgE合成等，使气道炎症加重，导致哮喘^[5]。

吸入SO₂易在呼吸道溶解并形成其衍生物^[7]。本研究表明，SO₂衍生物能增加人BEP2D细胞MUC5AC和IL-13 mRNA和蛋白表达，即使在染毒结束后的一段时间内，上述基因表达增加的效应仍然存在，提示SO₂衍生物对人BEP2D细胞的影响是通过转录和翻译水平的调节引起的，这可能是SO₂加重哮喘疾病的原因之一。