2007, Vol. 23
局部振动（segmental vibration）对机体血管内皮细胞内分泌功能的影响已在从业人群和动物实验中得到证实，但其发病及引起血管活性物质变化的机制尚未阐明[1]。细胞凋亡(apoptosis)是一种重要的生物学现象，其发生异常可能是致病因子作用的结果，与多种疾病的发生密切相关。细胞凋亡受相关基因、蛋白、细胞因子的调控。bcl-2基因家族的表达产物是凋亡的重要调控蛋白，其中bcl-2基因（B-cell lymphoma/leudemia 2 gene）抑制凋亡，而bax（bcl-associated x gene）促进凋亡，2者处于动态平衡，其平衡结果决定细胞是生存还是死亡。本研究分别以bcl-2、bax作为凋亡抑制基因和凋亡促进基因的代表，探讨振动对内皮细胞凋亡影响及其在振动性血管损伤发生过程中的作用。
1 对象与方法 1.1 实验动物选择3.5月龄的健康新西兰大白兔18只（鲁抗实验动物中心，产品合格号SCXK鲁20050017），体质量(2.35±0.15)kg，雌雄各半。将大白兔随机分为低剂量接振组，高剂量接振组和对照组，每组6只。
1.2 局部振动动物模型的制备将新西兰大白兔置于自制固定装置上，使其后肢密切接触振动台。噪声水平均为74.4［dB（A）］；低剂量组接振加速度68.6 m/s2，每天接振0.5 h，接振频率125 Hz，其强度换算为4 h等能量频率计权加速度有效值［four hours energy equivalent frequency weighted acceleration，ahw(4)］，为3.03 m/s2；高剂量组接振加速度197.0 m/s2，每天接振1.0 h，接振频率125 Hz，其ahw(4)为12.30 m/s2。接振试验45 d。
1.3 实验仪器与试剂D-150-1型电动振动台、KD-3型振动控制台（苏州试验仪器厂）；ND2精密声级计（北京精密仪器厂）；低温冰箱（美国科俊仪器公司）；Leica RM2235型切片机（德国Leica公司）；bcl-2及bax免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。
1.4 bcl-2及bax表达产物免疫组织化学染色接振试验结束后，处死家兔，迅速沿后肢股血管分支相同部位取肌肉标本，石蜡包埋，4 m连续切片，严格按试剂盒推荐的步骤操作。切片经二甲苯脱蜡后梯度乙醇水化，磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2～7.6）洗3次，30% H2O2消除内源性过氧化物酶的活性(37℃，10 min)，微波修复抗原，冷却后滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封闭液，室温20 min。滴加兔抗bax（或bcl-2）抗体，37℃1～2 h或4℃过夜。PBS洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，(20～37)℃ 20 min，PBS洗2 min×3次。滴加试剂链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC），(20～37)℃20 min。PBS洗5 min×4次。使用二氨基联苯胺（DBA）显色试剂盒。取1 ml蒸馏水，加(DBA)试剂盒中A，B，C试剂各一滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间，一般5～30 min。蒸馏水洗涤。苏木苏轻度复染。脱水，透明，封片，显微镜观察。PBS代替一抗做阴性对照。结果判断：bcl-2及bax阳性表达为细胞质内可见棕黄色颗粒沉着。400倍光镜下计算6个视野内的阳性细胞总数，取其平均值。
1.5 统计分析采用SPSS 10.0软件进行分析，进行显著性t检验。
2 结 果 2.1 家兔的一般情况家兔接振后出现进食减少、体重降低、褪毛等现象。随接振时间的延长，上述现象加重。而对照组无明显变化。
2.2 光镜下组织的病理变化接振组接振后血管内皮细胞的完整性破坏，血管壁增厚，中膜的平滑肌细胞增生，外膜变化不明显。部分病例可见血管壁的小附壁血栓形成、管腔狭窄闭塞等病理变化(图 1～4)。
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图 1 低剂量组bax 表达( × 400) |
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图 2 高剂量组bax 强阳性表达( × 400) |
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图 3 低剂量组bcl-2 表达( × 400) |
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图 4 高剂量组bcl-2 强阳性表达( × 400) |
2.3 bcl-2及bax蛋白的表达结果
与对照组比较，bax基因表达接振后显著增多，随接振剂量的增大，阳性细胞数增多、染色加深，差异有统计学意义（P＜0.01）。bcl-2基因表达与对照组比较，阳性细胞数也有增多趋势。bcl-2/ bax比值明显低于接振后（P＜0.05），见表 1。
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表 1 不同接振时间家兔细胞bcl-2及bax蛋白的表达( x ± s, n= 6) |
3 讨 论
细胞凋亡受相关基因、蛋白、细胞因子的调控，目前研究较多的有bcl-2基因家族，其家族成员中bcl-2抑制凋亡，而bax促进凋亡，2者处于动态平衡，决定细胞的生存与死亡。本研究结果表明，接振后家兔血管内皮细胞的完整性被破坏，血管壁增厚，中膜的平滑肌细胞增生；部分病例可见血管壁的小血栓形成、管腔狭窄闭塞等病理变化，与有关研究结果一致[2]。血管内皮凋亡抑制基因bcl-2表达高于对照组，而bax基因表达较对照组明显升高（P＜0.01），bcl-2/bax比值显著降低（P＜0.05），2者平衡失调，表明振动可能导致了血管内皮细胞的凋亡。
局部接振引起的血管内皮细胞凋亡可能与以下因素有关：（1）振动可导致细胞外信号调节激酶（ERK）被激活，进而导致细胞凋亡诱导因子（如炎性因子）的增多[3]。（2）振动能够导致脂质过氧化增强、肿瘤坏死因子（TNF）增高，可能直接或间接启动细胞凋亡机制[4-6]。（3）局部接振所引起的血流切应力的变化可导致内皮细胞的损伤，从而对血管内皮凋亡产生影响[7]。血管内皮细胞的凋亡导致其分泌功能失调，并可导致内皮下基底膜的暴露，导致血小板的黏附、小血栓形成等一系列的反应，后者是振动性血管损伤的主要病理改变之一，表明振动所致的血管内皮细胞凋亡与振动病的发生有重要联系，有必要在振动性血管损伤的发生机制研究中进行探讨。
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