肠产毒素菌大肠埃希菌（ETEC）是引起腹泻的重要病原之一，患者除腹泻也可呈轻度水泻或严重的霍乱样症状。ETEC中的肠毒素可分为不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）^[1]。目前检测肠毒素ETEC的方法主要有动物试验、组织培养和免疫学方法等，这些方法检测周期长，操作繁杂，灵敏度不高^[2]。一般PCR方法虽然操作简便、快速、特异性较强，但存在假阳性、灵敏度不高等问题 。基因芯片、蛋白质芯片检测ETEC的技术刚起步，且成本较高^{[3, 4]}。而荧光标记的定量PCR方法，既克服了一般PCR检测方法假阳性、灵敏度不高的问题，还可以对微生物进行定量检测^[5]。本文应用定时定量PCR方法，建立ETEC的LT毒素标准曲线，获得较为理想的结果。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

（1）实验菌株:C83902产毒素大肠埃希菌（中国兽医药品监察所）。(2) 主要仪器与试剂:TOMOS3-18M高速冷冻离心机（美国托莫斯公司）；2720/9700型PCR扩增仪（美国ABI公司）；Touching998A紫外可见呈像系统（上海天呈科技有限公司）；DU640型核酸分析仪（美国Beckman公司）；荧光定量PCR检测系统Line-GenenⅡ（杭州博日科技有限公司）。

质粒载体PMD18-T Vector[宝生物工程（大连）有限公司]；Taq DNA聚合酶(中国宝信公司)；dNTP与离心柱型高纯度质粒小提取试剂盒（德国TIAN GEN公司）；0.2ml薄壁管（美国Axygen公司）；其余试剂（北京赛百盛基因技术有限公司）。

1.2 方法 1.2.1 菌株培养及DNA模板制备

将菌株接种于20ml质脂双层(LB)液体培养基，37℃震荡150～200r/min，过夜培养。DNA提取采用热裂解法^[6]，取细菌培养液0.5ml，置于Eppendorf管中，2000r/min离心20min，灭菌蒸馏水洗涤2次，最后用1ml蒸馏水悬浮，隔水煮沸15min，8000r/min离心15min，取上清，即为DNA模板溶液，保存于-20C备用。

1.2.2 引物、探针设计与合成

根据Genebank S60731 LT毒素基因序列，选取结构基因内保守区段为目的片段，采用软件Express 2.0设计引物和相应的TaqMan探针序列。均由上海基康生物技术有限公司合成。引物及探针的序列分别为:P1 5-ACCTTTCCCTCAGGATGCTAAACCAGTA-3；P2 3-CGACACTTAACACAACATTAGGACGAAC-5；TaqMan荧光标记探针序列为:FAM-CCTGAAATGTTGCGCCGCTCTTAAATG-TAMRA。

1.2.3 PCR反应条件优化

调整模板、引物和聚合酶浓度以及循环次数和退火温度，反复多次进行PCR扩增，选取最佳的特异性扩增结果以确立最佳的PCR反应条件。

1.2.4 重组质粒定量分析与标准曲线构建

PCR产物经过纯化后，将其与载体连接和转化，经过37℃温育过夜培养后，挑选在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-半乳糖苷(X-Gal)、异丙荃--D-硫代半乳苷(IPTG)、氨苄青霉的(Amp)的L-琼脂平板培养基上形成的白色的小圆形单菌落,并经过菌落PCR扩增鉴定。将重组质粒按照取1l,用三蒸无菌水稀释至10l混合均匀,从中取出1l稀释至10l的，建立10倍系列稀释的标准品质粒（核酸分析仪测定浓度）。在0.2ml的Eppendorf管中进行PCR反应，采用25l反应体系，用10倍系列稀释的标准品质粒为模板，在实时荧光定量PCR仪上扩增。各反应组分为Mix(包含镁离子的10PCR buffer、dNTP、引物的混合溶液)17.5l；Taq DNA聚合酶1.25l；重组质粒DNA2.5l；灭菌三蒸水4.75l；荧光PCR反应条件选取两步法，抑值选为52℃，FAM轨道:94℃20s,60℃40s,40个周期。以重组质粒的对数浓度为横坐标,以PCR循环的Ct（Cycleofthreshold）值为纵坐标，采用Line-GeneⅡ^[7]软件计算可对ETEC进行相对定量的标准曲线。

2 结果 2.1 最佳PCR条件（图 1）

经过多次PCR扩增，得到最佳PCR反应液组合和反应条件。(1) 反应液:染料为5.0l，10PCR buffer（含镁离子）4.0l，10.0mmol dNTP1.0l，50mol引物（P1，P2）各0.5l，DNA模板1.0l，Taq DNA聚合酶(5U/l)0.5l，ddH2O 37.5l，Total 50l。(2) 反应条件:94℃预变性4min，94℃变性45s，50℃退火1min,72℃延伸1min，循环次数40周期。在此条件下，获得PCR扩增片段的大小为165bP。结果表明，所设计引物的特异性强，所得片段的长度与ETEC的LT毒素基因扩增序列长度吻合，可用于构建重组质粒。

2.2 标准曲线建立 2.2.1 动力学曲线（图 2）

重组标准品质粒10倍稀释系列按照1.2.4中的反应体系和反应条件下，进行实时荧光定量PCR扩增。得出实时定量PCR重组质粒DNA动力学曲线。结果显示，重组质粒DNA动力学曲线为典型的S形扩增曲线，指数期较明显，平台期汇于一条直线上；指数区较明显，斜率大且固定（平行线）；线性范围较广。

2.2.2 标准曲线

对重组质粒10倍稀释系列进行实时定量PCR扩增,系统根据荧光值的变化规律,通过基线和阈值的设定,系统自动生成标准曲线。运行分析程序，计算机可自动计算出相关系数、标准曲线的斜率、截距和误差。通过不断调节基线位置和改变阈值范围，使得重组质粒的各个有效反应点均落在曲线的相应位置上,最终得到标准曲线的斜率为-3.68；截距为44.78；相关系数为0.984；误差为0.042^[8]。

2.2.3 可靠性测定

对重组标准品质粒反应进行3次重复,其Ct值的平均值为(17.440.58) ，(23.150.85) ，(26.980.93) ，(32.451.59) ，(37.200.55) 说明该标准曲线可靠性较好。

2.4 样品测定

任意配制一个未知浓度的样品与重组标准品质粒的10倍稀释系列一起扩增，通过计算机上显示的Ct值可以在标准曲线上很简单的找到对应的起始模板的对数浓度。通过与未知浓度的样品的其他方法测定比较，结果基本吻合，说明该曲线具有很好的应用价值。

3 讨论

定量化的关键是标准曲线灵敏度的测定^[9]。因此，在进行RT-PCR之前，我们做了常规PCR的体系优化。通过反复实验对比，最终确定了最优的反应条件和体系，保证了实验具有较高的灵敏度。

扩增前期的重复性对样品含量测定非常重要，特别是在荧光临界值附近，相同样品的曲线越重合越好。扩增后期由于影响因素太多，曲线会分散，如仍符合S型，就不影响定量测定^[10]。样品测定的曲线扩增前期的重复性较好，测定结果可信度高。

本实验建立从基因水平检测肠毒素性大肠埃希菌ETEC毒素LT的定量PCR方法，获得了具有实际应用价值的标准曲线。为食品、药品中ETEC的快速检测以及LT毒素的快速诊断提供有利的手段。