热休克蛋白是生物体细胞在一系列应激因素作用下产生的具有高度保守性的一组细胞保护性蛋白质, 在生理状态下它们主要发挥细胞内功能^〔1〕, 其中热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP 70)家族与细胞保护之间的关系最密切, 它在机体细胞耐受形成、机体免疫调节、遗传物质保护、基因调控细胞增殖分化、肿瘤发生发展等过程中起重要作用^{〔2, 3〕}。HSP 70家族主要有诱导型的HSP 72和结构型的HSP 73两个亚型^{〔4, 5〕}, 在应激过程中特别是染毒过程中, 主要为HSP 72表达变化^〔6〕。本研究旨在通过分析焦炉工人外周血淋巴细胞HSP 72表达特征, 探讨焦炉逸散物对HSP 72表达的影响, 为焦炉工人的健康监护和预防保护提供理论依据。

选取某焦化厂267名工人为研究对象, 均为男性。根据作业环境和工作地点分为炉顶工80人, 炉侧工64人, 炉底工123人(含电工、瓦工、钳工、带运工、仪表工等30名对照选自2 km外的某医院医护人员和管理人员, 均为男性, 无有毒作业接触史。

由调查员采用面对面询问的方式采集研究对象基本信息, 填写调查表。内容包括性别、年龄、工龄、吸烟、饮酒、职业史、既往病史、生活环境、生活习惯、身体状况等信息。吸烟指数=吸烟支数/d×吸烟年限, 吸烟指数 > 100为吸烟。

采用个体采样方法进行采样。分别选取炉顶、炉侧、炉底、辅助作业区(行政办公楼、回收车间、机电作业区)和对照区工人各2名, 随身携带个体采样器(德国HSF 513型), 流量2 L/min连续采样6 h, 每个工作区重复测定2次。采用高效液相色谱法(Varian-Prostar高效液相色谱仪, 美国Varian公司)检测[B(a)b]芘浓度。

肘静脉采血5 ml, 肝素抗凝加淋巴细胞分离液(上海试剂二厂), 2000 r/min离心20 min吸取淋巴细胞层, 生理盐水清洗, 017%氯化氨裂解红细胞, 离心分离淋巴细胞。加冰冷的细胞裂解液, 4℃裂解1 h, 1000 r/min离心5 min, 取上清, 按DC protein assay试剂盒(美国BIO-RAD公司)方法进行总蛋白定量。调节蛋白浓度为1 mg/ml, 取100μl, 加等体积2×十二烷基磺酸钠(SDS)100μl 94℃变性10 min, 用于HSP 72的测定。

蛋白印迹(Western blot)法^〔7〕测定HSP 72。取10μl样品和高分子量蛋白maker进行电泳和转膜Mini-PROTEAN3型垂直电泳槽、Power PAC3000型电泳仪、小型T rans-Blot转印槽, (美国BIO-RAD公司)5%脱脂奶粉封闭, 37℃振荡1 h; 兔抗人HSP72单克隆抗体(1:40000, 美国stressgen公司)4℃孵育过夜, 磷酸盐缓冲液PBS)清洗15 min, 3次; 辣根过氧化物酶标记的羊抗免1 gG 1:10000, 美国KPL公司), 37℃孵育1 h, PBS洗清15 min, 3次; 电化学发光剂(英国Amersham公司)显色, Kodak X-O-MAT 2000自动冲片机洗片, 扫描, gel pro 3.2分析软件进行定量分析。HSP72表达水平用HSP72灰度值与对照样品灰度值的比值表示。

应用SPSS 10.0软件进行统计分析。单因素方差分析比较年龄、工龄组间差异, χ²检验比较吸烟、饮酒组间差异。HSP 72对数转换后呈正态分布, 用几何均数±标准差(G±S_G)表示, 多元协方差分析控制年龄、性别、工龄吸烟、饮酒等因素的影响, 比较组间差异。Logistic回归分析不同暴露等级引起HSP 72升高阳性的危险度。

267名焦炉作业工人年龄为21.35~48.54岁, 平均(37.34±5.81)岁; 工龄为1.17~29.10岁, 平均16.02±7.10)年; 现暴露水平接触时间1~29年, 平均11.82±7.69)年, 吸烟人数182人, 占68.16%, 饮酒人数132人, 占49.43%。30名对照年龄为25.61~43.36岁, 平均36.03±5.57)岁; 工龄为1.42~25.10年, 平均(15.12±6.97)年, 现暴露水平接触时间为1~25年, 平均(10.97±8.70)年; 吸烟人数17人, 占56.67%;饮酒10人, 占33.33%。炉顶、炉侧、炉底工人及对照各组年龄、现暴露水平接触时间、吸烟率、饮酒率比较差异无统计学意义(p > 0.05)。炉底和炉顶工人工龄差异有统计学意义(p < 0.05)。

炉顶、炉侧、炉底工作区B(a)P浓度分别为(0.35±0.02), (0.10±0.00)和(0.045 0.007) Lg/m³, 分别是对照(0.02±0.00) Lg/m³的17.5, 5, 2.25倍, 呈现炉顶 > 炉侧 > 炉底 > 对照区的趋势。

表 1

表 1 焦炉工人外周血淋巴细胞HSP 72表达水平

表 1 焦炉工人外周血淋巴细胞HSP 72表达水平

由表 1可见, 炉顶工、炉侧工淋巴细胞HSP 72表达水平显著高于对照组, 差异有统计学意义(p < 0.05), 炉侧工显著高于炉底工, 差异有统计学意义(p < 0.05), 炉顶工与炉侧工比较, 差异无统计学意义(p > 0.05)。以各不同作业场所B (a) P浓度均值与该作业区工人HSP 72表达几何均数进行曲线拟合, 呈二项式分布, R²为0.9999, 显示HSP 72表达呈现随着[B(a)b]浓度的升高而先升高后下降的趋势。

表 2

表 2 多元线性回归分析淋巴细胞HSP 72表达水平(对数转换值)影响因素

表 2 多元线性回归分析淋巴细胞HSP 72表达水平(对数转换值)影响因素

以HSP 72对数转换值为应变量, 以年龄、工龄、现暴露水平接触时间、吸烟指数、饮酒、暴露组别为自变量进行多元线性回归分析, 显示仅暴露组别对HSP 72表达水平的变化有统计学意义F=4.31, p < 0.05), 其中炉顶工、炉侧工偏回归系数B分别为0.082和0.097, p < 0.01, 炉底工偏回归系数B为0.042差异无统计学意义(p > 0.05)。该趋势与上述结果显示趋势一致。说明炉顶、炉侧焦炉逸散物引起焦炉工人处于应激状态, 诱导HSP 72表达水平升高, 而炉底工处于基础或弱应激状态。

表 3

表 3 不同暴露组别焦炉工人淋巴细胞HSP72表达阳性的OR值

表 3 不同暴露组别焦炉工人淋巴细胞HSP72表达阳性的OR值

以对照组HSP 72均值的95% CI上限值1.06为界值(≤1.06为阴性, ≥1.06为阳性), Logistic回归分析暴露引起HSP 72阳性的危险度, 扣除年龄、工龄、现暴露水平接触时间、吸烟、饮酒等因素的影响, 暴露引起的HSP 72表达阳性的调整OR为1.31(p < 0.05), 说明焦炉逸散物暴露是引起HSP 72表达升高的危险因素, 其中炉侧工调整OR值为2.69(p < 0.05), 在各组中最高。

表 4

表 4 吸烟、饮酒对焦炉工人淋巴细胞HSP 72表达水平的影响(G±SG)

表 4 吸烟、饮酒对焦炉工人淋巴细胞HSP 72表达水平的影响(G±SG)

在吸烟和饮酒人群中, 淋巴细胞HSP 72表达水平呈现炉侧工 > 炉顶工 > 炉底工和对照的趋势, 与表 1显示趋势一致其中, 炉侧工与对照和炉底工比较, 差异有统计学意义(p < 0.05), 炉顶工与炉底工比较, 差异有统计学意义(p < 0.05而在不吸烟和不饮酒人群中, 淋巴细胞HSP 72表达水平则呈现随着暴露等级升高而升高的趋势, 但各组之间差异无统计学意义(p > 0.05)。根据[B(a)b]暴露水平, 将焦炉工分为高暴露组(炉顶工、炉侧工)、低暴露组(炉底工)进行分层多元线性回归分析。在低暴露组, 饮酒与吸烟指数偏回归系数分别为-0.05和-0.0001, 显示对HSP 72表达的抑制作用。在高暴露组, 饮酒等各因素均未显示对HSP 72表达的显著影响。

本文研究结果显示, [B(a)b]高暴露的炉顶工、炉侧工外周淋巴细胞HSP 72表达水平明显高于低暴露的炉底工和对照, 表明焦炉逸散物可诱导其表达水平升高。但随着[B(a)b]浓度的升高, 炉顶工外周血淋巴细胞HSP 72表达水平并没有呈线性升高, 而是有回落的趋势, 与外暴露[B(a)b]浓度呈二项式分布。多元线性回归分析各暴露组偏回归系数和Logistic回归分析各暴露组HSP 72表达阳性的OR值均显示以上相同的趋势。焦炉逸散物中存在多种物质, 有研究显示高温、CO等因素均可诱导HSP 72表达升高^〔8〕。而体外细胞培养研究发现, 随着[B(a)b]染毒剂量升高和染毒时间延长细胞内HSP 70、HSP 72表达下降, 表现为[B(a)b]对HSP 70 HSP 72表达的抑制作用^{〔9, 10〕}, 可能是由于[B(a)b]的终代谢产物7, 8-二羟基-9, 10-环氧苯并(a)芘(BPDE)的亲电性使得BPDE容易与热休克因子(Heat shock factor, HSF)结合从而影响其与热休克反应元件(Heat shock element, HSE)的结合, 进而影响了HSP 72基因的转录和表达162。因此, 焦炉工人外周血淋巴细胞HSP 72表达水平是多种因素相互作用的结果。高暴露如炉顶工HSP 72表达下调可能与高剂量[B(a)b]表现的抑制作用有关。

Xiao^〔7〕研究了焦炉工人HSP70与细胞遗传损伤的关系发现二者呈显著负相关, 显示HSP 70对焦炉逸散物引起的遗传损伤具有保护作用。因此, HSP 72表达水平下调可能是一个危险信号, 它一方面提示环境[B(a)b]浓度可能显著升高另一方面, 意味着机体耐受能力的下降, 使得机体在高暴露损伤因素的作用下, 产生更为严重的细胞损伤和遗传损伤。因此, 对焦炉工人细胞HSP 72表达水平的监测可用于评价工人暴露水平的变化和预示细胞损伤恶化的转折, 为焦炉逸散物特别是[B(a)b]限量标准的制定提供依据。本研究也同时发现, 吸烟、饮酒对HSP 72的表达水平有一定的影响, 但仅显示在低暴露情况下对HSP 72表达的抑制作用, 可能是焦炉逸散物特别是[B(a)b]对HSP 72的表达的影响较大, 掩饰了吸烟和饮酒的作用, 提示对吸烟、饮酒的控制有利于改善机体的应激能力, 其机制尚需进一步探讨。