阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的慢性神经退行性疾病，主要病理特征为老年斑沉积、神经原纤维缠结及神经元丢失，神经元纤维缠结的密度及分配与痴呆程度呈正相关^[1]，且常常伴随着Tau蛋白的异常磷酸化。正常情况下，Tau蛋白与微管蛋白相结合，稳定神经元轴突的细胞骨架^[2]，然而Tau蛋白的磷酸化却明显降低了Tau蛋白与微管蛋白结合能力，导致轴突运输障碍，神经元纤维缠结，神经元丢失^{[3 – 4]}。研究发现，Tau蛋白磷酸化发生在AD早期，而与Aβ相关的临床症状被认为是发生在Tau蛋白磷酸化之后^{[5 – 7]}，因此，寻找可调节Tau蛋白磷酸化的药物将更有益于治疗AD。益智聪明汤由人参、茯苓、制首乌、肉苁蓉等10味中药组成，具有健脾益肾填精、除痰、化瘀之功效。研究表明益智聪明汤可改善Aβ_25-35侧脑室注射诱导AD模型小鼠的学习记忆障碍，但具体作用机制尚不清楚。本研究以Aβ_25-35侧脑室注射诱导AD模型小鼠为研究对象，探讨益智聪明汤对AD模型小鼠Tau蛋白磷酸化及神经元的影响，旨在为益智聪明汤临床治疗AD的应用提供理论依据。结果报告如下。

SPF（specific pathogen free）级昆明种小鼠60只，雌雄各半，8周龄，体重（20 ± 2）g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK（辽）2015-0001。小鼠适应性饲养1周后开始实验，分笼饲养，自由饮食。

益智聪明汤（辽宁中医药大学附属第二医院）由人参8 g、茯苓15 g、肉苁蓉10 g、益智仁10 g、知母12 g、菖蒲5 g、远志10 g、川芎10 g、赤芍10 g、牛膝10 g组成，含生药量1.08 g/mL；盐酸多奈哌齐片[卫材（中国）药业有限公司]，规格：5 mg/片；Aβ_25-35（美国Sigma公司，批号：053M4804V）；Tau-5（美国Invitrogen公司，批号：1261887A）；Rabbitanti-phospho-Tau（Thr231）、（Ser404）抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；Rabbit anti-phospho-Tau（Ser 396）抗体（美国Santa cruz公司）；抗β-actin鼠单克隆抗体（北京康为世纪生物科技有限公司）；山羊抗小鼠IgG（H + L）二抗、山羊抗兔IgG（H + L）二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；二氨基联苯胺显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；即用型链霉亲和素复合物（streptavidin-biotin complex，SABC）兔IgG试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；水合氯醛（天津市津东试剂厂）。DW-200脑立体定位仪（成都泰盟科技公司）；TD1002B电子台秤（四川中泯科技公司）；Western blot电泳仪（美国BIO-RAD公司）；BX51奥林巴斯显微镜（日本奥林巴斯株式会社）。

各组小鼠以10 mL/kg腹腔注射3.5 %水合氯醛麻醉后，固定于脑立体定位仪上，常规碘酒、酒精消毒。沿颅骨中线切开约2 cm，以囟门为零点，向后0.5 mm，旁开1.0 mm，深度为3.0 mm，将3 μL已经老化的Aβ_25-35于2 min内缓慢注入侧脑室内，留针5 min，缓慢拔针；假手术组注入同体积生理盐水。放入鼠笼饲养（注意保暖）。

小鼠按体重随机分为假手术组、模型组、益智聪明汤低、中、高剂量组（6.5、13.0、26.0 g/kg），多奈哌齐组（1.3 mg/kg），每组10只，造模后各组按20 mL/kg容积灌胃给药，每日给药1次，连续15 d，假手术组和模型组给予相应体积的蒸馏水。

给药期间定期观察小鼠一般状况，包括饮食、饮水、活动、精神状态等；给药结束后，小鼠连续禁食16 h，自由饮水，称量各组小鼠体重。

采用Western blot法，每组随机取3只小鼠快速断头，冰盘上分离海马，称重；经蛋白裂解液提取总蛋白，牛血清白蛋白法（BSA）测定蛋白浓度，10 %凝胶电泳，转膜，5 %脱脂牛奶封闭，一抗Ser 404（1 : 400）、Thr 231（1 : 500）、Thr 181（1 : 300）及Ser396（1 : 400）孵育，4 ℃静置过夜。磷酸盐缓冲液洗涤后加入山羊抗兔IgG（H + L）二抗（1 : 3 000）孵育，洗涤后加入超敏化学发光试剂，采用凝胶成像系统观察蛋白表达，采用Quantity One 4.6.2图像分析软件定量。

按常规方法对脑组织标本进行苏木素-伊红染色（hematoxillin-eosin，HE），各组小鼠以10 mL/kg腹腔注射3.5 %水合氯醛麻醉，剪开胸腔，暴露心脏，将输液针经心尖刺入左心室，右心耳处剪一小口，先用预冷生理盐水快速灌注，待右心房流出液体变透明时，将输液针连接至预冷的4 %多聚甲醛，先快后慢灌注，直至心脏发白、四肢及尾巴抽搐、僵硬时，断头取脑，4 %多聚甲醛4 ℃固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡及包埋后，石蜡切片机切片，厚度5 μm，脱蜡到水，染色，透明，封片，显微镜下观察。

计量数据采用 $\bar x \pm s$ 表示，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用最小显著差法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

各组小鼠观察期间饮食、饮水、活动、精神状态均正常；假手术组、模型组、益智聪明汤低、中、高剂量组、盐酸多奈哌齐组小鼠体重分别为（32.3 ± 1.3）、（31.5 ± 1.6）、（31.2 ± 1.1）、（32.7 ± 1.4）、（33.1 ± 1.2）、（32.1 ± 1.5） g；各组小鼠体重无明显差异。

与假手术组比较，模型组小鼠脑海马tau蛋白磷酸化位点Thr231、Ser404、Thr 181及Ser 396蛋白表达明显升高；与模型组比较，高剂量益智聪明汤组、盐酸多奈哌齐组小鼠脑海马tau蛋白磷酸化位点Thr231、Ser404、Thr 181及Ser 396蛋白表达水平明显降低（P < 0.05）。

图 1

注：1：假手术组；2：模型组；3～5：益智聪明汤6.5、13.0、26.0 g/kg组；6：盐酸多奈哌齐组。 图 1 益智聪明汤对AD小鼠海马组织tau蛋白表影响

表 1

表 1 益智聪明汤对AD小鼠海马组织tau蛋白表影响（ $\bar {x}\pm {s}$ ，n=3） 组别（g/kg） Ser 404 Thr 231 Thr 181 Ser 396 假手术组 1.000 ± 0.031 1.000 ± 0.134 1.000 ± 0.0768 1.000 ± 0.123 模型组 1.800 ± 0.172a 2.321 ± 0.140a 2.109 ± 0.145a 2.761 ± 0.250a 益智聪明汤 6.5 1.626 ± 0.041 2.178 ± 0.605 1.876 ± 0.132 1.738 ± 0.051b 13.0 1.212 ± 0.021b 1.839 ± 0.255 1.645 ± 0.125b 1.823 ± 0.159b 26.0 1.006 ± 0.158b 1.384 ± 0.122c 1.164 ± 0.125c 0.978 ± 0.122c 盐酸多奈哌齐组 1.108 ± 0.179b 1.214 ± 0.316c 0.921 ± 0.441c 1.012 ± 0.024c 　　注：与假手术组比较，a P < 0.05；与模型组比较，b P < 0.05，c P < 0.01。

表 1 益智聪明汤对AD小鼠海马组织tau蛋白表影响（ $\bar {x}\pm {s}$ ，n=3）

结果显示，假手术组小鼠脑海马区神经元细胞排列整齐，有序，间隙正常，细胞核清晰，核仁明显，胞浆着色均匀、淡染，细胞膜完整，细胞周围组织结构完整（图2A）；模型组小鼠海马区神经元细胞排列紊乱，水肿，细胞核固缩，胞浆着色不均，细胞膜边缘欠完整，可见神经元细胞死亡留下的空泡（图2B）；益智聪明汤6.5 g/kg组小鼠脑组织海马区神经元细胞排列疏松，锥体细胞层变宽（图2C）；益智聪明汤13.0 g/kg组小鼠脑海马区神经元细胞排列比较紧密，细胞核仁清晰，散在的神经元细胞减少（图2D）；益智聪明汤26.0 g/kg组小鼠海马区神经元细胞排列有序，锥体细胞排列紧密，细胞层数增加，部分神经元细胞的神经突触恢复（图2E）；盐酸多奈哌齐组小鼠脑组织神经元细胞排列整齐，锥体细胞层明显，可见少量核固缩，与周围组织存在间隙（图2F）。

图 2

注：A：假手术组；B：模型组；C、D、E：益智聪明汤6.5、13.0、26.0 g/kg组；F：盐酸多奈哌齐组。 图 2 益智聪明汤对AD小鼠海马神经元组织形态学影响（HE，×20）

AD的2个显著病理特征是细胞外老年斑（SP）和神经细胞内神经元纤维缠结（NFTs），前者核心成分是Aβ，后者由过度磷酸化的tau蛋白构成。目前，尚不清楚2大病理特征之间的相互联系。一般认为，在AD中，Aβ可以诱发或者加速tau蛋白的过度磷酸化，而过磷酸化的tau蛋白又可加速Aβ的沉积。研究表明在淀粉样前体蛋白/早老素-1（β-amyloid precursor protein/presenlin，APP/PS1）转基因鼠中，Aβ形成后出现tau蛋白过磷酸化，而tau蛋白转基因鼠并未发现Aβ沉积，说明发生AD时Aβ沉积应该在tau蛋白过磷酸化的上游^[8]，体外制备和阿尔茨海默病模型小鼠脑内提取的Aβ低聚物均可促进tau蛋白在AD特异位点的过度磷酸化^[9]。Götz^[10]等向转入P301L突变tau基因小鼠海马内注射凝聚态Aβ_1-40，导致其脑内NFTs增加5倍。另有研究发现，AD患者脑组织中存在Aβ与tau蛋白形成的复合体^[11]，此复合体可作为Aβ集聚点，加速Aβ聚合沉积^[12]。

在AD患者脑中，tau蛋白表现为异常过度的磷酸化，磷酸化水平是正常脑的3～4倍^[13]。流行病学调查显示，至少95 % AD患者存在tau蛋白病变^[14]。正常生理条件下，tau蛋白总是处于与微管结合或与其分离的动态平衡之中，这种状态是维持正常生理功能所必需的。研究认为，AD患者脑内存在的tau蛋白主要有过度磷酸化tau蛋白（ADP -tau），聚集为配对螺旋样纤维丝（paired helical filament，PHF）的tau蛋白（PHF-tau），还有正常tau蛋白（C-tau）。Tau蛋白至少有45个位点可以被磷酸化^[15]，调节tau蛋白与微管亲和力的位点则主要是丝氨酸与苏氨酸磷酸化位点^[16]，大多集中分布在脯氨酸富集区和C末端区，少数分布在微管结合区，以Thr181、Thr231、Ser262、Ser199、Ser396和Ser404等研究较深入，且它们的磷酸化被认为是AD发病的前兆^{[17 – 18]}。tau蛋白与Aβ之间存在着密切关系，AD脑内大量存在的Aβ可促使tau蛋白过度磷酸化，而过度磷酸化的tau蛋白又可加剧Aβ对神经元的毒性作用，表现为神经元的变性、丢失，且严重程度与认知功能障碍严重性呈正相关。

益智聪明汤由人参、茯苓、制首乌、肉苁蓉等11味中药组成，具有甘温益气，健脾养胃，甘温入肾，补益精血等功效。研究表明：人参提取物及人参总皂苷可改善痴呆模型小鼠学习记忆功能障碍^[19]；制首乌水煎剂可显著拮抗东莨菪碱所致小鼠记忆障碍，具有改善学习记忆的作用^[20]；肉苁蓉具有良好的抗AD作用，其改善学习记忆障碍的机制可能包括增强自由基清除酶活性、减轻脂质过氧化、抑制细胞凋亡、抑制活性氧生成抗炎及调节凋亡信号通路等^[21]。此外，肉苁蓉提取物还可提高神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中烟碱型乙酰胆碱受体α3及α7亚单位的蛋白表达水平，对抗Aβ造成的细胞损伤^[22]。石菖蒲可抑制AD模型大鼠脑组织中氧自由基的产生，减轻氧自由基对脑组织的损伤，提高其学习记忆能力，从而有效地改善和延缓脑组织衰老^[23]。远志总皂甙及远志根的正丁醇提取物均能改善AD模型动物的学习记忆功能，对老年性痴呆的胆碱能系统功能减退有一定的改善效应^[24]。本研究结果表明益智聪明汤可明显降低AD小鼠脑海马中tau蛋白磷酸化位点（Thr231）、tau（Thr181）、tau（Ser404）及tau（Ser 396）蛋白表达水平，改善小鼠脑海马区神经元细胞排列紊乱、水肿等现象，减少神经元死亡。提示，益智聪明汤可通过抑制Tau蛋白磷酸化表达水平，对大鼠脑海马内神经元起到保护作用，从而改善其学习记忆障碍。