2. 广东省职业病防治院, 广东 广州 510300;
3. 南方医科大学公共卫生学院, 广东 广州 510515
2. Guangdong Province Hospital for Occupational Disease Prevention and Treatment, Guangzhou 510300 China;
3. School of Public Health, Southern Medical University, Guangzhou 510515 China
人类可通过自然辐射（氡气、地面辐射和宇宙射线等）和人工辐射（应用于医疗诊治和核工业等的X射线、γ射线和中子等）接触低剂量电离辐射（LDIR）。由于受到辐射种类、辐射剂量、辐照时间等不确定性的影响，目前LDIR生物学效应研究尚无一致结论[1]。LDIR可能通过启动G2/M细胞周期停滞，防止DNA未修复的细胞进行有丝分裂，同时充分修复受损DNA序列，保证细胞活力，但长时间细胞周期停滞可导致细胞衰老[2]。细胞衰老是一种由端粒缩短、癌基因激活、线粒体功能障碍和活性氧增多等多种信号驱动的细胞状态[3]。衰老细胞具有细胞形态改变、不可逆细胞周期阻滞、氧化应激、分泌衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）、衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated-β-galactosidase, SA-β-Gal）活性增高等特点，并通过转化生长因子β1（TGF-β1）、基质金属蛋白酶9 （MMP-9）等SASP募集和激活多种免疫细胞调节免疫反应，从而促进衰老细胞的消除[4]。研究表明，细胞周期调节、衰老、DNA损伤修复和抗氧化等机制之间相互作用可调控细胞应对低剂量辐射诱导的轻微应激，提高细胞存活可能性[5]。随着高通量测序技术的快速发展，敏感个体的基因表达谱分析有利于大规模辐射损伤的精准评估和早期预防。目前关于长期低剂量辐射诱导肺损伤的研究尚无一致结论，且细胞衰老在LDIR诱导放射性肺损伤中的机制研究较少。基于此，本研究旨在以人支气管上皮（HBE）细胞为研究对象，通过构建肺细胞衰老模型，采用高通量测序技术分析分次LDIR诱导肺细胞衰老过程中的差异表达mRNA及相关生物学过程与通路，为分次LDIR诱导肺组织损伤的早期个体化防治提供重要实验基础。
1 材料与方法 1.1 细胞、试剂与仪器HBE细胞（中山大学李道传副教授惠赠）；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline, PBS）、改良Eagle培养基 （dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM）（美国Gibco公司）；总RNA提取剂（total RNA extraction reagent, Trizol）（美国Invitrogen公司）；实时荧光定量PCR试剂盒（日本Takara公司）；二氧化碳恒温培养箱（美国Thermo Fisher 公司）；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗β-肌动蛋白（β-actin）抗体（美国Abcam公司）；羊抗兔IgG二抗、兔抗TGF-β1、兔抗MMP-9抗体（中国Proteintech公司）；ChiRad 160 X射线辐照仪（台湾达尔生技有限公司）。
1.2 细胞分组与辐照HBE细胞在含10%胎牛血清与1%青-链霉素双抗的DMEM培养基中培养，培养条件为饱和湿度、37 ℃、5% CO2的培养箱。细胞分组为对照组、50 mGy × 7组、100 mGy × 7组、200 mGy × 7组。待细胞长至80%达到对数生长期，使用ChiRad 160 X射线辐照仪（剂量率为50 mGy/min）分别对各剂量组细胞进行X射线均匀辐照。辐照后置于培养箱继续培养，每隔72 h辐照1次，共辐照7次。
1.3 SA-β-Gal染色分别于辐照7次结束后24和48 h对各组别细胞进行SA-β-Gal染色。使用PBS清洗细胞1次，按照每9 cm2∶1 mL比例加入SA-β-Gal染色固定液进行固定，室温静置15 min后用PBS清洗，共3次；避光配制染色工作液（A液∶B液∶C液∶X-Gal溶液 = 1∶1∶93∶5），清洗结束后吸除PBS，按照每9 cm2∶1 mL比例加入染色工作液，于37 ℃避光孵育过夜。光学显微镜下观察细胞，并对SA-β-Gal染色阳性面积占比进行分析。
1.4 SASP相关基因mRNA水平检测分别于辐照7次结束后24和48 h收集细胞。采用Trizol法提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书逆转录为cDNA，以cDNA为模板进行扩增检测。以β-actin作为内参，采用2−ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。各基因实时荧光定量PCR（quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction, qPCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，β-actin：上游引物5’-GGCACCCAGCACAATGAAG-3’，下游引物5’-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3’；TGF-β1：上游引物5’-CAATTCCTGGCGATACCTCAG-3’，下游引物5’-GCACAACTCCGGTGACATCAA-3’；MMP-9：上游引物5’-AGACCTGGGCAGATTCCAAAC-3’，下游引物5’-CGGCAAGTCTTCCGAGTAGT-3’。
1.5 SASP相关蛋白表达水平检测分别于辐照7次结束后24和48 h收集细胞蛋白。吸除培养液，用预冷的PBS洗3次，加入120 μL含有裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的混合物，冰上裂解30 min后收集细胞，4 ℃、12000 rpm离心15 min，收集上清测定蛋白浓度后，进行Western Blot实验。经过蛋白变性、制胶、上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、化学发光、条带灰度扫描等步骤后分析各剂量组TGF-β1和MMP-9蛋白表达水平。
1.6 分次低剂量辐射HBE细胞差异表达分析于辐照7次结束后48 h收集细胞，交由康成数谱公司进行测序。通过NanoDrop ND-100测定样品浓度后选取1～2 μg总RNA构建RNA测序文库，经文库质量鉴定与定量后采用Illimina NovaSeq 6000测序仪进行测序。由软件StringTie与R软件Ballgown 进行基因水平的Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments （FPKM）计算，对各组中FPKM均值超过0.5的基因进行统计分析。按照|log2 Fold Change| > 1，即差异倍数 > 2的阈值进行差异表达基因筛选。采用公司自定义程序（python /R/ shell）进行差异表达基因的聚类分析、基因本体学（Gene Ontology，GO） -生物学过程（biological process, BP）与京都基因与基因组大百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析等并进行可视化绘图。
1.7 统计学分析采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。数据以平均值±标准差表示。不同剂量两组间数据通过方差分析进行比较，两组间比较采用LSD检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果 2.1 分次低剂量辐照HBE细胞衰老染色辐照HBE细胞7次结束后24和48 h分别进行SA-β-Gal染色。辐照后24 h，与对照组相比，各剂量组细胞形态逐渐变大变扁平，且SA-β-Gal产物于细胞质中浸润较明显。各剂量组细胞SA-β-Gal染色阳性面积占比差异具有统计学意义（F = 164.940，P <0.001）。与对照组相比，各剂量组细胞SA-β-Gal染色阳性面积占比均显著升高（P < 0.05），呈剂量-效应关系。辐照后48 h，随着辐照剂量增加和辐照后观察时间增加，衰老阳性细胞铺展面积增大，出现空泡化。100 mGy × 7组和200 mGy × 7组细胞出现β-半乳糖苷酶产物弥漫整个细胞。各剂量组细胞SA-β-Gal染色阳性面积占比的差异具有统计学意义（F = 82.435，P < 0.001）。与对照组相比，各剂量组细胞SA-β-Gal染色阳性面积占比均显著升高（P < 0.05），呈剂量-效应关系。见图1。
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图 1 分次低剂量辐照HBE细胞不同组别SA-β-Gal染色情况 Figure 1 SA-β-Gal staining in different groups of fractional low-dose irradiated HBE cells 注：A. 辐照后24 h不同组别SA-β-Gal染色情况；B. 辐照后48 h不同组别SA-β-Gal染色情况；C 辐照后24和48 h不同组别SA-β-Gal染色阳性区域面积占比。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。 |
辐照HBE细胞7次结束后，分别检测各剂量组细胞SASP相关基因mRNA水平。结果显示，辐照后24 h，各剂量组细胞TGF-β1 mRNA水平差异具有统计学意义（F = 27.998，P <0.001）。各剂量组细胞MMP-9 mRNA水平差异均具有统计学意义（F = 16.554，P = 0.001）。与对照组相比，100 mGy × 7组和200 mGy × 7组TGF-β1 与MMP-9 mRNA水平均显著升高（P < 0.01）。辐照后48 h，各剂量组细胞TGF-β1 mRNA水平差异具有统计学意义（F = 150.445，P <0.001）。各剂量组细胞MMP-9 mRNA水平差异具有统计学意义（F = 6.636，P = 0.015）。与对照组相比，各剂量组细胞TGF-β1 与MMP-9 mRNA水平均显著升高（P < 0.05）。见图2A与2B。Western Blot结果显示，与对照组相比，辐照后24和48 h，各剂量组TGF-β1蛋白表达水平均升高。与对照组相比，辐照后24 h，100 mGy × 7组与200 mGy × 7组MMP-9蛋白表达水平均升高；辐照后48 h，各剂量组细胞MMP-9蛋白表达水平均升高。见图2C与2D。
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图 2 分次低剂量电离辐射诱导HBE细胞SASP表达情况 Figure 2 Expression of SASP in HBE cells induced by fractional low-dose ionizing radiation 注：A. 辐照后不同组别TGF-β1 mRNA水平；B. 辐照后不同组别MMP-9 mRNA水平；C. 辐照后24 h SASP基因蛋白表达水平；D. 辐照后48 h SASP基因蛋白表达水平。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。 |
通过高通量测序筛选出各剂量组差异倍数 > 2（|log2 Fold Change| > 1）的基因。与对照组相比，50 mGy × 7组差异mRNA共882个，其中上调558个，下调324个；100 mGy × 7组差异mRNA共475个，其中上调268个，下调207个；200 mGy × 7组差异mRNA共1205个，其中上调766个，下调439个。差异表达基因中，细胞衰老通路（KEGG ID: hsa04218）TGF-β1基因在3个剂量组中与对照组相比均上调（|log2 Fold Change| > 1），50 mGy × 7组、100 mGy × 7组与200 mGy × 7组差异倍数分别为3.07、2.57与2.66倍。
2.4 分次低剂量辐照HBE细胞差异表达基因生物学过程与通路分析GO功能注释结果显示，与对照组相比，50 mGy × 7组主要参与对刺激反应的调节、氮化合物代谢过程的调控等生物学过程；100 mGy × 7组主要参与细胞周期、刺激反应、细胞分裂、氮化合物代谢过程、染色体分离调控等生物学过程；200 mGy × 7组主要参与氮化合物代谢过程调控、刺激反应、RNA代谢过程调控等生物学过程。各剂量组均参与对氮化合物代谢过程的调控、刺激反应的生物学过程。见图3。
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图 3 不同剂量分次低剂量辐照HBE细胞差异表达基因的GO生物学过程分析 Figure 3 GO biological process analysis of differentially expressed genes in HBE cells irradiated with different doses of fractional low-dose irradiation |
KEGG分析结果显示，与对照组相比，50 mGy × 7组主要富集在白细胞介素-17（interleukin 17, IL-17）通路、细胞周期、细胞衰老与铁死亡等信号通路；100 mGy × 7组主要富集在细胞周期、核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路、细胞衰老等信号通路；200 mGy × 7组主要富集在细胞周期与病毒致癌作用等。与对照组相比，3个剂量组均富集于细胞周期的通路。见图4。
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图 4 不同剂量分次低剂量辐照HBE细胞差异表达基因的KEGG通路分析 Figure 4 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes in HBE cells irradiated with different doses of fractional low-dose irradiation |
本研究通过构建分次LDIR诱导HBE细胞衰老模型，初步探讨LDIR诱导细胞衰老中的差异表达mRNA及其相关生物过程与通路。
Tang等[6]采用剂量率为1.11 Gy/min的X射线分别对人正常支气管上皮细胞进行500 mGy × 1，500 mGy × 2，500 mGy × 3与500 mGy × 4的照射，结果发现辐照诱导的细胞上皮间质转化呈剂量-效应关系。Lafargue等[7]对原代人肺微血管内皮细胞进行15 Gy X射线单次辐照后，细胞SA-β-Gal染色阳性占比呈剂量和时间依赖性增加。本研究对人HBE细胞进行分次低剂量辐照后发现细胞衰老染色阳性面积占比与SASP相关因子表达均增高。Verma等[8]对小鼠采用12 Gy γ射线辐照后发现小鼠肺组织TGF-β1蛋白水平升高。李贞等[9]分别采用0、5、10、20 Gy γ射线辐照小鼠巨噬细胞6、12、24、48 h后发现，MMP-9 mRNA表达均显著升高。上述研究结果与本研究发现各剂量组辐照后24和48 h均引起HBE细胞衰老及48 h后SASP相关因子mRNA和蛋白水平均增高的结果相似，提示分次LDIR与较高剂量单次辐射均可引起SASP相关因子mRNA和蛋白表达增高[10]并促进细胞衰老发生。
本研究高通量测序结果显示，3个剂量组差异表达基因分别为882、475和1205个。相关研究报道对人外周血采用50 mGy和150 mGy单次辐照后进行转录组测序，分别鉴定出876个和 486个差异表达基因[11]。本研究测序结果显示，与对照组相比，TGF-β1在3个剂量组中增高差异倍数均 > 2，且各剂量组辐照后48 h TGF-β1 mRNA水平显著增高，辐照后24与48 h蛋白表达增高的趋势一致。提示分次低剂量辐照HBE细胞诱导TGF-β1 mRNA水平增高可能通过影响细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p15Ink4b、p21和p27等基因mRNA水平而在细胞衰老通路（KEGG ID: hsa04218）中发挥重要作用[12]。
Pustovalova等[13]通过高剂量电离辐射分次照射A549和H1299肺癌细胞（总剂量为60 Gy）进行转录组学分析，结果显示不同辐射时间的电离辐射诱导两株细胞损伤可激活SASP相关基因和NF-κB等信号通路。本研究采用分次低剂量辐照HBE细胞构建衰老细胞模型并进行差异mRNA生物学过程与功能分析，GO功能分析结果显示，各剂量组都参与对氮化合物代谢过程的调控和刺激反应生物学过程，提示HBE细胞接受分次低剂量辐照可引起刺激反应[14]，可能通过氮化合物代谢过程调控细胞形态改变和细胞分化诱导细胞衰老[15]。与对照组相比，50 mGy × 7组和200 mGy × 7组生物学过程在HBE细胞代谢过程的调控方面较显著，100 mGy × 7组的差异表达基因主要参与细胞周期等。结合本研究中辐照后24和48 h细胞MMP-9 mRNA与蛋白水平，提示100 mGy剂量分次辐照在调控细胞衰老效应方面更显著。KEGG分析结果显示，各剂量组均富集于细胞周期的通路，其中50 mGy × 7组和100 mGy × 7组均富集于细胞衰老通路。已有研究发现IL-17信号通路中IL-17A与内皮细胞衰老之间关联由NF-κB /p53/Rb通路介导[16]。本研究中50 mGy × 7组、100 mGy × 7组分别富集于IL-17和NF-κB信号通路，提示50 mGy × 7组和100 mGy × 7组促进细胞衰老的作用可能分别与IL-17和NF-κB信号通路有关。Fang、Chopra和Dahl等[11, 17-18]在细胞和动物实验中也发现电离辐射相关的功能通路包括有丝分裂、衰老、铁死亡、刺激反应、信号调节和NF-κB信号通路等。与本研究相关信号通路富集结果较一致，提示分次LDIR诱导细胞损伤可能通过调控细胞周期而引起细胞衰老。
不同于以往单次高剂量辐照，本研究成功构建分次LDIR诱导人HBE细胞衰老模型，通过高通量测序筛选出细胞衰老通路相关差异表达基因。各剂量组差异表达基因主要参与对氮化合物代谢过程的调控与刺激反应的生物学过程，并富集于细胞周期、细胞衰老等通路。后续研究将结合生物信息学结果，深入探讨细胞信号通路在分次低剂量辐射诱导肺细胞衰老中的作用机制。
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