放射性肺损伤（radiation-induced lung injury，RILI）作为肿瘤放疗常见的严重并发症[1]，主要包括两个阶段：早期阶段成为放射性肺炎（radiation pneumonitis，RP），其主要特征为辐射诱导的肺组织炎症[2]；另一阶段为晚期阶段的放射性肺纤维化（radiation fibrosis，RF）阶段[3]。由于RILI缺少有效的治疗手段，其死亡率甚至高于多种癌症。因此深入了解放射性肺损伤的发病机制，旨在为临床防治提供新的治疗靶点。
RNA功能与多种甲基化修饰有关[4]，其中，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是表观转录组学中丰度最高，最广泛的RNA修饰[5]。m6A是指当腺苷酸的第6位N原子连接的氨基上发生了甲基化修饰，这一修饰在哺乳动物昼夜节律，DNA损伤反应，热休克反应，纤维化的发生发展和肿瘤的发生发展等生物学过程起重要调控作用[6]。m6A修饰是动态可逆的，在机体发生生理变化情况下发挥动态调控作用。m6A修饰可以发生在多种RNA中，其中，mRNA上的m6A丰度较高，并且具有一定位置和序列特异性，因此，m6A修饰也具有特异调控功能。甲基化酶（writer）可以进行m6A修饰；去甲基化酶（eraser）则能够去除m6A修饰；此外，识别蛋白（reader）对m6A修饰进行识别，进而诱导mRNA翻译过程的发生或mRNA降解[7]。
GATA结合蛋白-3（GATA binding protein-3，GATA3）是GATA家族的成员，其家族由GATA1到GATA6组成[8]。GATA3由443或444个氨基酸组成，具有2个激活域和2个锌指结构[9]。近年来研究发现GATA3在调控肺损伤的发生发展过程中发挥了重要的作用[10]。m6A甲基化酶VIRMA，是甲基转移酶复合物中最大的已知成分，从SUN结构域开始包含一个N端和一个C端，参与调控细胞 mRNA甲基化修饰的全过程。有研究表明，GATA3是VIRMA介导的m6A修饰的直接下游靶基因。VIRMA通过诱导GATA3 pre-mRNA发生m6A修饰，进而影响GATA3的表达[11]。GATA3的m6A修饰在放射性肺损伤的作用至今尚未报道。本研究通过探讨肺上皮细胞辐射反应中GATA3的表达变化及m6A修饰的调控机制，为放射性肺损伤的发生与临床防治提供新的治疗靶点。
1 材料与方法 1.1 细胞和照射条件人肺上皮细胞A549细胞照射条件：180 kV，20.0 mA，总剂量10 Gy，剂量率1.0 Gy/min，靶皮距70 cm。小鼠肺上皮细胞MLE-12细胞照射条件：320 kV，12.5 mA，总剂量6 Gy，剂量率0.75 Gy/min，靶皮距60 cm。
1.2 主要试剂和仪器RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时荧光定量-聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒（中国大连宝生物工程公司），鼠抗GAPDH抗体、兔抗β-actin抗体、兔抗N-cadherin抗体、兔抗Vimentin抗体、HRP山羊标记抗兔二抗和HRP山羊标记抗鼠二抗（美国Bioworld公司），兔抗GATA3抗体（英国Abcam公司），兔抗VIRMA抗体（美国NOVUS公司）。X-RAD320生物辐照仪（美国PXI公司），自动酶联免疫标记仪和EX180TM酶标仪（美国Bio-Tek公司）。
1.3 利用比色法定量检测m6A RNA甲基化水平RNA结合：预先确定实验所需的条孔数量；向每个孔中加入BS（bing solution，结合溶液）；200 ng样品RNA添加到指定孔中，摇匀；用密封板盖住条板，并在37℃下孵育90 min；吸出PBS。WB（wash buffer，清洗缓冲液）洗涤3次。m6A RNA捕获：每孔加CA(capture antibody，捕获抗体)，室温孵育60 min，吸出CA溶液，WB洗孔3次；每孔加DA(detection antibody，检测抗体)，室温孵育30 min，吸出DA溶液，WB洗孔4次；每孔加ES(enhancer solution，增强溶液)，室温孵育30 min，吸出ES溶液，WB洗孔5次。信号检测：每孔加入DS(developer solution，显色液)，室温避光孵育10 min；当阳性对照孔中的颜色变蓝时，向每孔加入SS(stop solution，终止液)停止反应。加入SS后颜色变黄，在15 min内在酶标仪上读取450 nm处的吸光度。m6A计算：利用公式计算总RNA中m6A的百分比。
1.4 采用qRT-PCR法检测受照的A549和MLE-12细胞中VIRMA、GATA3和EMT标志物的mRNA的表达水平在PubMed的GenBank数据库中检索出VIRMA，GATA3和EMT相关标志物的基因序列，委托上海生工生物科技有限公司设计并合成荧光定量PCR引物，引物序列见表1。用RNA提取试剂盒提取肺组织总RNA，逆转录试剂盒进行逆转录，利用qRT-PCR试剂盒于PCR扩增仪中检测基因相对表达水平。PCR反应条件：95℃、5 min；95℃、30 s ，60℃、30 s ，72℃、30 s ，40个循环。以GAPDH作为内参照，采用2−△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达水平。
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表 1 qRT-PCR引物序列 Table 1 Sequences of qRT-PCR primers |
加入预冷的PBS刮取细胞沉淀，4℃ 1200 rpm/min离心5 min后去掉上清液，加入遇冷的蛋白裂解液RIPA，离心收集上清，BCA蛋白定量，加入蛋白上样缓冲液并煮沸5 min。蛋白上样，SDS-PAGE凝胶电泳并转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，二抗室温孵育2 h，TBST洗3次，ECL显色液显色，在凝胶成像系统中显影。
1.6 利用慢病毒转染法建立稳定敲低 VIRMA 的细胞模型首先将pMD2G、psPAX2和pPLK-GFP-shVIRMA质粒与转染试剂Lipo 2000加入到无血清的DMEM培养基中混匀，室温静置20 min后，逐滴加入到培养皿内，轻柔地充分混匀。6 h后吸走原来的培养液，换成含有血清的DMEM新鲜培养液。细胞培养48 h后荧光显微镜下观察转染效果，收集培养基（含慢病毒）。其次，将病毒液与培养基1∶1混合后，加入0.1%的polybrene后感染A549细胞和MLE-12细胞，每12 h感染1次，一共感染4次。最后，感染结束后加入嘌呤霉素进行筛药，筛药14 d后将仍能存活的细胞即为稳定敲低VIRMA的细胞模型。
1.7 统计学分析所得数据用SPSS 24.0软件进行统计学分析，用GraphPad Prism 5画图。不同组间比较经正态性分布符合正态分布，采用独立样本t检验；P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 肺上皮细胞受照后中总RNA的m6A水平变化利用比色法检测给予肺上皮细胞照射后总RNA m6A水平变化。如图1所示，与对照组A549-control相比，与对照组A549-control 细胞相比，A549-IR细胞中总RNA的m6A水平升高2倍左右（P < 0.01）。如 图1所示，与对照组MLE-12-control相比，MLE-12-IR细胞在照射后总RNA的m6A水平升高4倍左右（P < 0.01）。
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图 1 A549细胞和MLE-12细胞照射后总RNA m6A水平 Figure 1 m6A of total RNA in A549 and MLE-12 cells after irradiation 注：n = 3，与control组相比，**P < 0.01。 |
利用Western Blot检测给予肺上皮细胞A549细胞和MLE-12细胞照射后GATA3和VIRMA的蛋白水平表达变化。如图2（A）所示，与对照组A549-control相比，A549-IR细胞中，GATA3和VIRMA蛋白水平均升高。
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图 2 A549细胞和MLE-12细胞照射后VIRMA和GATA3的表达变化 Figure 2 Changes in the expression of VIRMA and GATA3 in A549 and MLE-12 cells after irradiation 注：n = 3，与control组相比，**P < 0.01，*P < 0.05。 |
利用qRT-PCR法检测A549细胞和MLE-12细胞照射后中GATA3和VIRMA的mRNA水平表达变化。如图2（B）所示，与对照组A549-control相比，A549-IR细胞中，GATA3的mRNA水平升高（P < 0.05），VIRMA的mRNA水平也升高（ P < 0.01）。与对照组MLE-12-control相比，MLE-12-IR细胞中，GATA3的mRNA水平升高（ P < 0.01），VIRMA的mRNA水平也升高（ P < 0.01）。
2.3 肺上皮细胞受照后EMT标志物表达变化利用Western Blot检测给予肺上皮细胞A549细胞和MLE-12细胞照射后EMT标志物蛋白水平表达变化。如图3（A）所示，分别与对照组A549-control和MLE-12-control相比，A549-IR和MLE-12-IR细胞中，上皮标志物E-cadherin的蛋白表达水平均降低，而间充质标志物N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平均明显升高。
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图 3 A549细胞和MLE-12细胞照射后EMT标志物的表达变化 Figure 3 Changes in the expression of EMT markers in A549 and MLE-12 cells after irradiation 注：n = 3，与control组相比，**P < 0.01，*P < 0.05。A：Western Blot B：qRT-PCR。 |
利用qRT-PCR法检测给予肺上皮细胞A549细胞和MLE-12细胞照射后EMT标志物的mRNA水平表达变化。如图3（B）所示，与对照组A549-control相比，A549-IR细胞中，E-cadherin的mRNA水平降低（P < 0.05），N-cadherin和Vimentin的mRNA水平均明显升高（ P < 0.01）。与对照组MLE-12-control相比，MLE-12-IR细胞中，E-cadherin的mRNA水平降低（ P > 0.05），N-cadherin和Vimentin的mRNA水平均升高（ P < 0.01）。
2.4 干扰甲基化酶VIRMA后GATA3的表达变化利用Western Blot检测，敲低甲基化酶VIRMA后给予A549细胞和MLE-12细胞照射后GATA3和VIRMA的蛋白水平表达变化。如图4（A）所示，分别与对照组A549-control和MLE-12-control相比，A549-IR和MLE-12-IR细胞中，GATA3蛋白水平升高。而与A549-VIRMAlow相比，A549-VIRMAlow-IR组中GATA3蛋白表达水平无明显变化，与MLE-12-VIRMAlow相比，MLE-12-VIRMAlow-IR组中GATA3蛋白表达水平也无明显变化。
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图 4 干扰VIRMA后A549细胞和MLE-12细胞照射后GATA3的表达变化 Figure 4 Changes in the expression of GATA3 in A549 and MLE-12 cells after knockdown of VIRMA 注：n = 3，与control组相比，**P < 0.01，*P < 0.05。A：Western Blot B：qRT-PCR。 |
利用qRT-PCR法检测，敲低甲基化酶VIRMA后给予A549细胞和MLE-12细胞照射后GATA3的mRNA水平表达变化。如图4（B）所示，与A549-VIRMAlow相比，A549-VIRMAlow-IR组中GATA3 mRNA水平无明显变化（P > 0.05），与MLE-12-VIRMA low相比，MLE-12-VIRMAlow-IR组中GATA3 mRNA水平也无明显变化（P > 0.05）。
2.5 干扰VIRMA后肺上皮细胞中的EMT标志物表达变化利用Western Blot检测，敲低甲基化酶VIRMA后给予A549细胞和MLE-12细胞照射后EMT标志物蛋白水平表达变化。如图5所示，分别与对照组A549-control和MLE-12-control相比，A549-IR和MLE-12-IR细胞中，上皮标志物E-cadherin的蛋白表达水平均降低，而间充质标志物N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平均明显升高。而与A549-VIRMAlow相比，A549-VIRMAlow-IR组中EMT标志物蛋白表达水平无明显变化，与MLE-12-VIRMAlow相比，MLE-12-VIRMAlow-IR组中EMT标志物蛋白表达水平也无明显变化。
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图 5 干扰VIRMA后A549细胞和MLE-12细胞照射后EMT标志物蛋白表达变化 Figure 5 Changes in the expression of EMT marker proteins in A549 and MLE-12 cells after knockdown of VIRMA |
放射性肺损伤是胸部肿瘤放射治疗后最常见的并发症，RILI通常分为早期辐射损伤（在放疗后数小时至数天内发生）和晚期辐射损伤（在放疗后数月至数年发生），主要包括组织纤维化、坏死、萎缩和血管损伤[12]。接受放射治疗的肺癌患者中50%可发生肺炎，高剂量区域的肺纤维化率可高达70%～80%[13]。肺泡由单层气道上皮细胞 （Airway epithelial cells，AEC） 覆盖的薄壁组成，Ⅰ型AEC中散布着相对罕见的Ⅱ型AEC。Ⅱ型AEC产生表面活性物质，在肺泡损伤后，还能够产生Ⅰ型和Ⅱ型AEC 以重新填充肺泡上皮。本研究通过给予肺上皮细胞A549和MLE-12细胞X射线辐照，模拟体外放射性肺损伤的发生发展过程。大量研究已经表明，mRNA的m6A修饰肺损伤发生发展过程中包括炎症、EMT、肌成纤维细胞分化和ECM沉积在内的各个阶段都起到重要作用[14-15]。为了探讨放射性肺损伤发生发展过程中是否发生m6A修饰，本研究利用比色法进行检测，结果显示，给予A549细胞和MLE-12细胞X射线照射后，细胞总RNA的m6A水平明显升高，因此我们认为RILI的发生发展过程中发生了m6A修饰。
有研究显示，巨噬细胞参与了肺损伤的发生。GATA3可以通过抑制IL-12Rβ和信号转导和转录激活因子4（Signal transducer and activator of transcription 4，STAT4）的表达以抑制巨噬细胞向Th1细胞的分化，并可以通过诱导Th1细胞发生染色质重塑，使已极化的Th1细胞出现Th2表型，因此，GATA3在肺损伤进程中可能起到关键作用[16]。本研究结果显示，给予肺上皮细胞照射后的GATA3转录和蛋白水平均明显升高，并且上皮标志物E-cadherin表达量降低，而间充质标志物N-cadherin和Vimentin的表达量显著升高，说明GATA3可能通过诱导细胞发生上皮间充质转化，从而在RILI发生发展过程中起到调控作用。
有研究发现，METTL3/METTL14/WTAP/VIRMA/HAKAI/ZC3H13是m6A甲基转移酶复合物的关键成分，VIRMA以非依赖RNA的方式与该复合物结合，其N端在招募催化核心成员METTL3/METTL14/WTAP中起主要作用。METTL3，METTL14和WTAP都不能直接调控细胞内的特异性修饰位点，而VIRMA可以在诱导GGACU序列发生特异性m6A修饰中起关键作用。VIRMA能够介导GATA3 pre-mRNA 3' UTR上的m6A修饰，干扰人抗原R（Human antigen R，HuR）与GATA3 pre-mRNA的结合，调控GATA3转录水平的表达变化。并且GATA3-AS是VIRMA在GATA3 pre-mRNA上靶向进行m6A修饰的顺式作用元件[11,17]。本研究利用m6A2Target网站（ http://m6a2target.canceromics.org/）进行预测，我们发现，VIRMA是GATA3发生RNA m6A修饰的相关writer之一，这说明GATA3可能是VIRMA的直接下游靶基因。结果显示，给予细胞照射后，VIRMA和GATA3的转录和蛋白水平明显升高，因此我们认为辐射通过上调甲基化酶VIRMA，诱导肺上皮细胞发生了m6A修饰，从而增强GATA3的转录，进而提高GATA3蛋白的翻译水平。为了更加清晰的阐明上述观点，本研究在肺上皮细胞A549和MLE-12细胞中敲低了甲基化酶VIRMA的表达，进一步检测了GATA3和EMT相关标志物的表达变化，结果显示，与control组相比，单纯照射组细胞（A549-IR和MLE-12-IR）中GATA3和间充质标志物N-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达水平均明显升高，而敲低VIRMA后再给予细胞照射后，GATA3和EMT标志物都无明显变化。这说明甲基化酶VIRMA在调控辐射诱导的m6A修饰中起关键性作用。
综上说明，辐射上调肺上皮细胞A549和MLE-12细胞中甲基化酶VIRMA，诱导细胞发生m6A修饰，同时促进GATA3基因的转录和蛋白翻译，诱导上皮—间质转化（EMT）过程的发生，进而影响放射性肺损伤的发生与发展。本研究初步阐明了肺上皮细胞的辐射反应中GATA3的表达和m6A修饰的调控机制，为放射性肺损伤的发生机制与临床防治提供新的治疗靶点，对提高胸部肿瘤放疗疗效具有重要意义。
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