大规模辐射或核事故发生后，可能会使成千上万人暴露在未知和可变剂量的辐射之下。需要对大量的人员进行快速的分类诊断，确保将有限的医疗资源用到最需要的人身上。在没有物理剂量计的情况下，生物剂量估算在剂量评估方面起着非常重要的作用^[1]。但现有的生物剂量估算能力往往无法满足大规模核事故应急的需求，因此迫切需要建立快速、高通量、自动化的生物剂量检测技术，有助于对人员的快速分类诊断，有效的指导医疗救治，消除大规模恐慌，评估暴露后癌症及其他长期疾病的风险。

辐射生物剂量估算技术是基于可能受电离辐射影响的生物过程或生物标记物，从而估算个体的辐射剂量。目前常用的生物剂量自动检测方法是基于Metasystem的分析系统建立起来的，主要依赖于显微镜成像分析，会受到玻片制备、图像扫描和分析所需时间的限制，并且对玻片样本的制备质量要求较高，需要专业技术人员进行复核^[2-3]，我国目前有关染色体畸变自动分析估算剂量的研究主要采用显微镜成像分析技术^[4]。由于成像流式细胞术具有成像和量化分析的优点，为实现核事故发生时大规模人员快速、高通量剂量估算技术提供可能。本文主要对基于成像流式细胞术的生物剂量自动化估算技术相关研究进行综述，为研发快速、高通量的生物剂量估算检测装备提供思路。

1 成像流式细胞术概述

成像流式细胞术（imaging flow cytometry ，IFC）是将传统流式细胞术的高通量优势与显微镜的灵敏度和特异性相结合而发展起来的一项较新的技术。传统的流式细胞检测技术仅可以对单个细胞或亚细胞层面分子进行快速定量分析，获得的细胞信息是散点图上的一个点，缺少细胞形态、结构及亚细胞信号分布的相关信息，因此在细胞结构及分子在细胞内的分布相关应用具有一定的局限性^[5-6]。而IFC在成像时具有扩展景深选项，允许来自不同焦平面的光同时在探测平面上成像^[7-8]，多个检测通道可对细胞图像进行多参数量化分析，不仅具有传统流式细胞术的特点，还可实现单个细胞高分辨率的成像及细胞的可视化，获得细胞形态学、细胞内部分子分布情况和细胞状态的变化等量化信息^[9]，因此利用成像流式细胞术可以获得染色体的具体信息，可为基于IFC分析染色体畸变提供可能。此外IFC可实现荧光强度自动调节，操作简单易学，图像自动分析模板在实验室间共享，便于在核应急时使用，有利于大规模放射事件中多个实验室协同进行生物剂量的评估^[5]。因此，基于成像流式细胞术进行生物剂量估算技术具有快速、自动化、高通量、样本量少、使用便捷等优点，在自动化生物剂量估算技术的研发中具有很好的前景。

2 成像流式细胞术在微核检测中的应用

胞质分裂阻滞微核（the cytokinesis block micronucleus, CBMN）检测是辐射生物剂量学中的一项成熟技术，根据双核淋巴细胞微核频率确定暴露个体的辐射剂量^[10]。早在1984年，就有研究人员试图利用流式细胞术进行微核测定，虽然与基于显微镜的方法相比，传统的流式细胞术增加了CBMN分析的通量，但在区分中期细胞的微核和游离染色体方面仍然存在局限性。基于IFC的CBMN检测可获取荧光标记细胞的高分辨率图像，不仅能够使用传统的门控方法识别细胞群，捕捉核染色和全细胞形态的图像，对所有获取的图像进行视觉验证，并能对图像进行自动分析，避免对细胞外MN或其他DNA碎片进行评分，提高了分析的准确性^[11]。此外，该方法也可显著提高微核的检测速率，Bryce等^[12]报道，在样品培养结束后，处理11个样品，传统显微镜人工处理约需1 h，而利用IFC仅需10～20 min，使分析速度大大提高。但采用IFC技术进行分析，同一样品获得的微核细胞率比人工观察降低了一个数量级^[13]，这可能与IFC获得的图像是三维细胞的二维投影，会导致一些MN隐藏在主核后面或微核所处的景深不同，分析图像时，无法被清楚识别或被遮挡，因此没被纳入评估；也可能与采用的是图片面积进行MN识，可能会遗漏一些面积较小的MN。此外，目前常用的图像分析软件包为IDEAS®，主要基于特征图像进行分析，需要专业的人员进行，不利于推广应用，Rodrigues等^[14]开发了一种基于卷积神经网络的深度学习方法进行微核图像，克服了基于特征的图像分析的局限性，优于IDEAS®基于图像特征的分析，有助于MN分析的完全自动化。因此，该技术的进一步推广还需要加大样本分析或开发3D图像识别技术，完善参数设置，优化图像识别能力。

基于IFC进行微核检测进行剂量估算的自动化研究方面，为了进一步提高微核检测的自动化程度，哥伦比亚大学研究人员通过优化样品制备方案，将IFC-CBMN检测方案集成到其开发的快速自动化生物剂量测定机器人RABiT-II工作站中^[15]，形成了基于IFC的CBMN自动检测分析系统。具体样品制备分析流程为在96孔板中加入50 μl血液和200 μl培养基，使用自动化的多通道吸管对每孔样本混合5次，培养皿置于自动培养箱中，孵育24 h后，加入细胞松孢素。培养结束时，用机械臂取下板盖，用96孔板离心机进行离心，用微孔板清洗机从每孔中取出上清。离心抽吸后，系统自动对所有样品进行低渗、红细胞裂解、清洗、染色、图像采集及分析。该系统可实现样本检测仅需血样50 μl，从细胞培养结束到样本制备完成仅需1 h，1次可自动制备96个样品，24 h内处理大约2 300个样品。因此，该系统可为大规模核事故大量人员生物剂量估算提供快速、高通量的自动化检测分析技术。

总之，将成像流式细胞术应用到微核的检测中，已大大提高检测速率及通量，但在检测的准确、便捷方面还需要进一步的优化，此外还需将已建立的技术应用到大量的人群验证中，以确保剂量估算的准确性，促进其在大规模核辐射事故中的应用。

3 成像流式细胞术在双着丝粒染色体检测中的应用

双着丝粒染色体分析（dicentric chromosome assay, DCA）被认为是辐射生物剂量学的金标准，但分析非常耗时，只有在少量人员需要进行生物剂量估算时才可行。目前，为了应对大规模核与辐射事故人员快速分检的需求，通过将分析的细胞数量减少到50个^[16]，并简化评分方法^[17]，来提高DCA的检测速率及通量。由于IFC-DCA不需要玻片样本的准备、扫描及评分，分析时间较传统DCA明显缩短。成像流式细胞术进行DCA，主要通过对中期细胞溶解，制备染色体悬浮液，通过对染色体和着丝粒进行荧光标记，对视场中的所有对象进行聚焦，从而识别单个染色体，并区分单着、双着和多着丝粒染色体^[18]。在样本制备过程中，科研人员进行了大量的研究，促使该方法的进一步完善，如在进行染色体分离时，采用KCl法比多巴胺法更快^[19]，但多巴胺法可使染色体悬液稳定存活数周，这与多胺具有稳定染色体结构的作用有关^[20-21]，因此在应用中根据实际需求选择适当的方法。此外，使用无RNA酶的移液管和试管可以减少样品的降解，使染色体可以在溶液中稳定存在较长时间（5～6周）^[18,22]。在收获细胞前4 h向培养液里加入秋水仙素，可避免长期作用使染色体小且不易分散的现象，减轻悬浮染色体聚集。此外，由于检测的样本是悬浮状态下的染色体，因此会存在染色体聚集的现象，缠绕在一起的染色体被排除，从样本中检测到的染色体数量减少，因此样本制备时还需要进一步的摸索出更优的制备方法。基于IFC获得的双着丝粒畸变率的剂量-反应曲线，也符合一元二次方程模型，但由于许多染色体被排除，假阳性率较高，如传统的DCA方法检测的本底值为，染色体畸变率为 0.05%～0.1%，而成像流式细胞术检测的结果为3%^[18]，因此基于成像流式细胞术进行DCA，还需要在样品制备及图像分析仍需要进一步优化，如考虑，使用端粒探针区分2条非常接近的染色体或双着丝粒染色体。

综上所述，IFC应用于染色体畸变分析虽可提高分析速度，但降低假阳性率仍是进一步研究重点。由于基于成像流式细胞术的染色体畸变分析法检测的终点是每个染色体群体的双着丝粒染色体频率，具有一定的局限性，无法识别局部辐射暴露。此外，将建立类似RABIT的自动样本制备系统与成像分析系统进行集成也是未来工作的重点，将进一步提高分析的自动化程度。

4 成像流式细胞术在γH2AX检测中的应用

除了上述2种常用的生物剂量估算方法之外，生物剂量学中使用的其他方法也适用于IFC。Lee等^[23]开发出一种基于IFC分析人外周血细胞DNA双链断裂，建立了辐照后24 h内不同时间点，0～4 Gy γ-H2AX的剂量响应关系。Bourton等^[24]也建立了一种利用IFC进行γH2AX分析的方法，并证明了γH2AX荧光信号随剂量变化可达到8 Gy，并将IFC测量的焦点数与显微镜测量的焦点数进行比较，研究表明IFC测量的焦点数量较少，这与使用IFC进行的CBMN检测的结果相似，其中测量的MN频率也低于显微镜下通常测量的频率，因此为了生物剂量估算的准确性考虑，需要建立基于不同方法的剂量效应曲线。

5 展　望

成像流式细胞术用于生物剂量估算，不需要将样品从悬浮液转移到载玻片上进行分析，可以利用悬浮液直接分析，大大缩短检测时间，可弥补显微镜的不足。同时图像分析系统可以实现高通量数据分析，易实现在相似的系统之间共享，有利于在生物剂量测量网络成员间的交流。因此利用成像流式细胞仪进行样本处理，可为实现核事故发生时大规模人员快速、高通量剂量估算提供可能。随着技术的不断进步，开发便携式成像流式细胞仪检测γH2AX可用于事故现场快速分诊。此外，自动化样品处理系统的开发，将使整个测定能够自动执行、批量处理，分析系统的进一步完备，使分析结果在实验室间共享。同时，自动化设备的使用不仅可以提高实验室的检测速度，提高工作效率，同时可以避免实验人员和有毒气体的接触。

未来在应对大规模核与辐射事故人员分诊时，可利用γH2AX IFC检测在事故发生后24 h内对人员进行快速初筛，减轻人员恐慌。随后利用高通量CBMN和DCA方法对初筛人员进行进一步准确的剂量估算，指导医疗救治。此外，随者新的分子生物标志物的不断验证确定，可以与γH2AX组合使用，以提高现场剂量估计的准确性。为大量人员分诊提供更准确、快捷的生物剂量估算技术，提高核应急响应及救援能力。但技术的推广应用，需要建立一套完备的标准化操作流程，这也是未来需要研究的重点。