放射性肺损伤(Radiation-Induced Lung Injury, RILI) 是胸部恶性肿瘤放射治疗引发的常见并发症，其包括2个阶段：早期放射性肺炎(Radioactive Pneumonia，RP)表现为组织炎症，晚期放射性肺纤维化(Radiation-induced Pulmonary Fibrosis，RPF）表现为成纤维细胞过度增生、胶原和细胞外基质大量沉积^[1]。电离辐射诱导细胞DNA损伤、活性氧（ROS）产生，导致免疫细胞聚集，诱导细胞因子白介素（IL）、转化生长因子（TGF）大量释放^[2]。因此，放射性纤维化被认为是多种效应细胞、细胞因子等共同参与的复杂免疫反应^[3-4]。作为免疫系统的重要组成部分，补体能够参与中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞等炎症细胞的募集^[5]，在炎症反应中发挥重要作用。但补体在放射性肺损伤中的作用研究鲜有报道。本研究通过观察不同补体（C2、C3、C4、C5等）在⁶⁰Co γ射线单次20 Gy胸部照射诱发早期放射性肺炎和晚期放射性肺纤维化中的变化规律，为放射性肺损伤防治研究提供新线索，并利用体外培养的肺上皮细胞，探索辐射损伤细胞的补体反应的机制。

1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器

戊巴比妥钠（Merck，德国），TRI Reagent（Sigma，美国），小鼠补体成分2（C2）酶联免疫试剂盒（CUSABIO，中国），补体成分3a（C3a）检测试剂盒、补体成分4（C4）检测试剂盒、末端补体复合物C5b-9（C5b-9）检测试剂盒（Cloud-clone，中国），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，中国），C3a Rabbit pAb (ABclonal，中国)，T-PER^TM组织蛋白提取试剂（Thermo，美国），CD45-APC-Cy7抗体、CD3e-FITC抗体、CD4-PE-Cy7抗体、CD8α-Percp抗体、CD11c-APC-Cy抗体（BD，美国），SuperReal荧光定量预混试剂（TIANGEN，中国）。钴源（Co-60，英国维瑞斯公司），MULTISKAN GO全波长酶标仪(Thermo，美国)，CFX96 Touch荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad，美国)，FACSCalibur流式细胞仪（BD，美国）。

1.2 实验动物饲养及分组

120只6～8周龄、体重18～20 g的SPF级雄性C57BL/6小鼠（北京维通利华生物科技有限公司）[动物许可证号：SCXK（京）2019-0006]，随机分为12个组（6个对照组、6个照射组），每组小鼠10只。饲养于军事科学院军事医学研究院实验动物中心，饲养环境：温度：18～22℃，相对湿度：50%～60%，照明：10～14 h，换气：8～20 次/h。

1.3 实验细胞及培养

Beas-2B细胞为本实验室所存。Beas-2B细胞用LHC-8无血清培养液，置37℃，5% CO₂的恒温细胞培养箱中培养。当细胞密度达到80%～90%时，用0.25%的胰酶消化，按照实验要求细胞数进行接种或传代。将接种后Beas-2B细胞随机分为对照组、照射组。

1.4 实验方法 1.4.1 ⁶⁰Co γ射线照射

利用军事医学研究院辐射医学研究所钴源照射室进行⁶⁰Co γ射线照射。

动物照射时，将小鼠麻醉（1%戊巴比妥钠，50 mg/kg，腹腔注射），固定在自行设计的动物照射装置上，除胸部照射部位（面积3.0 cm×1.5 cm）外，其余部位用铅砖（10 cm厚）屏蔽遮挡。置于照射室，与放射源距离3 m处，一次照20 Gy，照射剂量率69.42 cGy/min，照射时间28:49 （min/s）。同时对照组进行假照射。

细胞照射前1天按照实验要求细胞数进行接种，培养24 h后进行照射。将细胞置于照射室，与放射源距离3 m处，照射剂量率69.42 cGy/min，分别照射2∶53、5∶46、8∶25、11∶31 （min/s），即照射剂量为2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy，同时对照组进行假照射。照射后各组更换新培养液继续培养。

1.4.2 肺病理切片的制作、染色及病理形态学观察

小鼠麻醉处死后，放血，取出全肺，分离出右肺置于−80℃冻存，左肺置于10%福尔马林溶液固定。固定结束后石蜡包埋，常规病理切片，进行HE染色和Masson三色染色后在普通光学显微镜下进行观察。

1.4.3 流式细胞检测

肺组织白细胞、DC细胞和T细胞亚群分别在照射后第1、2、3、7、15 d将小鼠麻醉，放血，取小鼠右肺剪碎后胶原酶消化，置于40 µm细胞筛网过滤得到肺单细胞悬液，单细胞悬液分为2管，分别加入CD16/32抗体，室温孵育15 min，一管加入CD45-APC-Cy7、CD3e-FITC、CD4-PE-Cy7、CD8α-Percp抗体进行染色，一管加入CD11C-APC-Cy抗体染色，4℃孵育60 min。流式细胞仪进行检测。

1.4.4 ELISA检测

肺组织匀浆液中补体含量称取小鼠肺组织0.05 g，加入1 mL PBS（含蛋白酶抑制剂），匀浆仪匀浆后离心（3000 r/min，15 min），收取上清液，即肺组织匀浆液。ELISA试剂盒检测待测补体C2、C3a、C4及补体复合物C5b-9的OD值，通过试剂盒标准品所得OD值构建标准曲线，计算得到补体的浓度，BCA试剂盒检测肺组织匀浆液总蛋白浓度，求得待测补体在总蛋白含量。

1.4.5 Western Blot检测肺组织补体C3a蛋白表达水平

称取肺组织0.05 g，加入1 mL组织蛋白提取液，匀浆仪冰上匀浆，4℃ 10000 g离心5 min，收取上清液，微量分光光度计检测蛋白提取液中蛋白浓度。将相同的蛋白质浓度进行免疫印迹分析，一抗稀释1000倍，4℃下孵育过夜，二抗室温孵育1 h，显影检测肺组织补体C3a蛋白表达水平。

1.4.6 RT-PCR检测补体mRNA表达水平

提取细胞中总RNA并逆转录合成cDNA。cDNA与SYBR Green PCR Master Mix和基因特异性引物预混后进行RT-PCR，半定量每个目标基因的实时PCR数据表示为与对照相对定量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。数据以 $\bar x \pm s $ 表示，组间两两比较采用t检验。检验水准α = 0.05。

2 结　果 2.1 ⁶⁰Co γ射线单次20 Gy胸部照射所致小鼠放射性肺损伤观察 2.1.1 早期肺部炎性反应

⁶⁰Co γ射线单次20 Gy胸部照射C57BL/6小鼠后1 d、3 d、7 d、15 d，肺组织中炎性相关细胞分子检测结果如图1。可以看出，反应基础免疫的CD45⁺白细胞占比（图1A）明显减少（P < 0.05），辐射损伤作用明显。负责抗原提呈的DC细胞比例（ 图1B）明显增高（P < 0.05），辐射所致炎性反应明显。辅助细胞免疫的CD4 ⁺T细胞亚群百分数（图1C）除7 d外（减少），基本无明显变化；细胞毒效应的CD8⁺T细胞亚群百分数（图1D）在照射后早期减少（P < 0.05），7 d后开始明显增高（ P < 0.05）。这也DC介导辐射损伤肺上皮细胞的抗原提呈致T细胞特异性活化结果一致。

2.1.2 小鼠胸部照射后肺脏病理改变

⁶⁰Co γ射线单次20 Gy胸部照射C57BL/6小鼠后30 d和180 d，肺组织切片病理观察结果如图2。可以看出，照射后30 d，小鼠肺组织炎性反应仍很明显，并呈现早期纤维化反应症状，表现在肺泡壁增厚，肺泡腔融合，肺泡数量减少，血管明显扩张，大量红细胞渗出，少量白细胞浸润等。照后180 d，小鼠肺组织呈现典型的纤维化症状，包括肺组织结构严重破坏，肺泡腔明显缩小，胶原纤维大量弥漫于整个肺部，并可见明显纤维化病灶形成等。

2.2 放射性肺损伤过程中的补体反应

⁶⁰Co γ射线单次20 Gy胸部照射C57BL/6小鼠后1 d、3 d、7 d、15 d、30 d、180 d，ELISA检测肺组织中补体C2、C3a、C4和补体复合物C5b-9含量，结果如表1。照射后不同补体（复合物）的反应存在差异明显，其中，补体C2、C4和补体复合物C5b-9除在早期（3 d或7 d）有一过性增高（P < 0.05）外，其他时间均与对照组无明显变化，提示这些补体可能与照射引起的炎性反应有关。补体C3a在照射后各时间点均高于对照组，但可能是由于C3a片段太小，ELISA检测结果比其他补体低1～2个量级，为此，对相同组织样本补体C3a进行Western Blot检测，结果如 图3。肺组织补体C3a在照射后3～180 d均明显高于对照组水平，表明补体C3a参与了放射性肺纤维化发生发展的全过程，提示通过调控补体C3a及其受体可能发现有效防治放射性肺损伤的新途径。

2.3 辐射所致补体反应机制

RT-PCR检测不同剂量⁶⁰Co γ射线照射后人支气管上皮细胞（Beas-2B细胞）补体C2、C3、C4、C5的mRNA表达水平，结果如图4。补体C2、C3的mRNA表达水平与照射剂量明显相关，可能提示其与细胞的放射损伤关系密切；而补体C4、C5的mRNA表达水平与照射剂量无明显相关性，表明其与肺细胞照射损伤无关，而可能通过机体内其他细胞参与炎性反应。6 Gy⁶⁰Co γ射线照射后不同时间Beas-2B细胞内补体C2、C3、C4、C5的mRNA表达水平如图4B。补体C2 mRNA表达水平在照射后24 h开始增高，36 h达到峰值，48 h后开始下降，与体内ELISA测定的结果完全一致。补体C3 mRNA表达水平在照射后48 h内持续高表达，进一步提示补体C3可能与肺上皮细胞照射后反应有关，这与上述体内实验结果完全一致。

3 讨　论

放射治疗是治疗胸部恶性肿瘤的主要方法之一^[6]，然而相关报道指出胸部放疗患者5%～20%会发生RILI，其发生率高、预测性低、治疗困难是困扰医学界的难题^[7-8]，如何有效减少放射性肺炎的发生、减轻肺纤维化的程度是研究的重点热点，故而探索其发病机制是解决这一问题的关键。本研究利用⁶⁰Co γ射线对小鼠进行单次20 Gy胸部照射，观察到早期（15 d内）白细胞数降低、DC细胞增多和T细胞亚群特异性活化等明显的放射性肺炎反应。照射后6个月，小鼠肺组织结构严重破坏，肺泡腔明显缩小，胶原纤维弥漫整个肺部，并可见明显纤维化病灶形成，诊断为典型的放射性肺纤维化疾病。

补体系统由30多种蛋白及可溶性或膜结合蛋白受体组成，主要通过经典途径、旁路途径和凝集素（MBL）途径3种途径激活^[9]，在免疫防御、调节免疫应答及病理损伤中起着十分重要的作用。补体C2、C4是补体经典途径和MBL途径的重要组成部分，二者是免疫防御发挥重要作用，有研究报道补体C2、C4的完全或部分缺乏与感染易感性增加有关^[10-11]。本研究结果发现γ射线胸部照射小鼠早期肺组织匀浆中补体C2、C4明显增高，后恢复到对照组水平，结果提示补体C2、C4参与了放射性肺损伤的早期反应，补体C2、C4含量增多与机体辐射后的诱发免疫防御有关，同时补体C2、C4的肺组织激活可能会导致经典途径或MBL途径的激活，引起下游反应，进一步参与早期的炎症反应。然而，体外研究发现，人肺上皮细胞Beas-2B照射后C2 mRNA水平升高而C4 mRNA无明显变化，表明补体C2与细胞的放射损伤关系密切，而补体C4可能通过机体内其他细胞参与炎性反应。

补体复合物C5b-9是补体活化的最终产物，也是膜攻击复合物（Membrane Attack Complex，MAC），可以杀伤致病细胞，在先天性免疫和获得性免疫中均发挥重要作用。本研究发现补体复合物C5b-9在小鼠胸部照射早期出现一过性增高，这与C2、C4的变化趋势一致，由此我们推测辐射早期引起补体通过经典途径或MBL途径活化致使补体复合物C5b-9含量增加参与早期反应。同时相关研究指出补体复合物C5b-9能够增强组织因子和粘附分子的表达，促进趋化因子^[12]和血小板激活因子的释放^[13]，促进炎症、增加血管通透性^[14]。推测早期免疫复合物C5b-9增高，可能参与早期的炎症反应。同时研究指出C5b-9可以杀伤致病细胞，导致细胞坏死，也可促进ROS的产生^[15]，提示照射早期肺损伤可能与照射后C5b-9增多有关，故而我们推测补体复合物C5b-9在放射性肺损伤前期发挥重要作用。

补体C3a是补体活化的重要产物，也是免疫系统中重要的趋化介质，能够上调或下调不同的细胞因子，在免疫反应中发挥不同作用。本研究发现照射后小鼠肺组织C3a持续高表达，提示补体C3a作为趋化介质参与早期的炎症反应；相关研究指出补体C3a能够激活树突状细胞(DC)和调节T细胞信号传导^[16]，我们前期的研究发现γ射线照射后调节T细胞持续激活^[17]，同时DC细胞在照射后早期明显增高，提示照射后早期C3a高表达与DC激活及Treg增多存在相关联系；相关研究指出补体C3a能够上调 TGF-β转录，抑制smad7的表达^[18-19]，阻断补体C3a受体（C3aR）能够抑制TGF-β表达，减轻纤维化^[20]，提示补体C3a在照射晚期高表达可能参与放射性肺纤维化的形成。以上结果提示C3a参与了放射性肺纤维化发生发展的全过程，提示通过调控补体C3a及其受体可能是防治放射性肺损伤的新途径。

综上所述，γ射线照射导致小鼠肺组织补体C2、C3a、C4及补体复合物C5b-9在不同时相出现增高，提示补体以不同方式在放射性肺损伤过程中发挥重要作用，补体C3a在照射后就呈高表达状态，参与了放射性肺纤维化发生发展的全过程，提示通过调控补体C3a及其受体可能是防治放射性肺损伤的新途径。