辐照技术被誉为加工技术的第三次革命，广泛用于工农业及医疗环保领域。其主要利用放射性同位素产生的 γ 射线或电子加速器产生的电子束照射物体，通过电离和激发诱发物质发生一系列物理、化学及生物学变化，导致物质的降解、交联、聚合等，使产品的品质或性能得以改善或保持。该技术加工流程简单，反应易于控制，适宜于产业化与规模化^[1]。辐照灭菌是辐射加工领域最为成熟的应用之一，通过电离辐射直接或间接作用杀灭微生物而起到消毒灭菌作用。电离辐射致病毒灭活已广泛应用于食源性病毒控制、生物制品病毒控制及高风险病毒实验室样品制备等。

1 电离辐射与病毒 1.1 电离辐射与辐照灭菌

辐射是某种物质发出的粒子或波，根据电离能力分为电离辐射和非电离辐射。能够引起电离的带电粒子和不带电粒子称为电离辐射，如γ射线、α射线、β 射线、中子等。电离辐射又分为直接电离辐射和间接电离辐射，其中直接电离辐射为那些具有足够大的动能，以致通过碰撞就能引起物质的分子、原子电离的带电粒子；间接电离辐射是能够释放出直接电离粒子或引起核变化的非带电粒子，如光子、中子等。更准确的说，凡是与物质直接或间接作用时能使物质电离的一切辐射均为电离辐射^[2]。

辐射灭菌是辐射最广泛和最成功的应用之一。其广泛应用于食品加工、医疗卫生用品、中草药等的消毒灭菌。1896 年，在发现 X 射线后不久，人们就认识到电离辐射可以杀死微生物这一事实。电离辐射对食品、农副产品、医疗卫生用品等进行加工处理，作用于微生物内部的核酸（DNA或RNA）、蛋白质等分子，诱发核酸碱基序列改变，蛋白质或核酸分子交联、化学键断裂等，导致细菌、病毒等微生物死亡，实现物品及其包装材料的杀菌、消毒^[3]。依据大量微生物学、毒理学和营养学方面的研究，早在1999 年国际原子能机构（IAEA）、联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）就提出以10 kGy 剂量作为食品辐照的国际安全线^[4-5]。对于组织移植材料的辐照消毒，IAEA将25 kGy 的辐射剂量定义为组织移植物灭菌的参考剂量。不同组织库选择辐照剂量也存在一定差异，整体使用15～35 kGy的辐射剂量。但为了保持组织的生物力学和其他特性完整，一些组织库更喜欢较低辐射剂量^[6]。

1.2 病毒及其危害

病毒是一类体积较小，由核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构成的非细胞形态微生物。其不具备独立的细胞结构，一般由蛋白质外壳和内部的核酸组成，有些病毒的蛋白质外壳外边有糖蛋白和脂质形成的包膜。体形大小多为20～300 nm，形态主要有球形、杆形和蝌蚪形。病毒由于缺乏完整的酶系统和代谢系统而只能寄生于活细胞中，以自我复制的方式增殖。不同病毒在环境中的生存力及对消毒剂等外界刺激的耐受性因病毒结构、成分、及形态差异而不同^[7]。病毒可通过多种方式传播导致人类感染而诱发疾病。

病毒性疾病预防越来越关注食源性病毒感染、血液制品、同种异体及异种组织修复材料等病毒感染的风险。食源性病毒被视为食源性疾病的主要原因。其中，人类诺如病毒 （hNoV）和甲型肝炎病毒（HAV）是食源性疾病暴发的罪魁祸首^[8]。人源诺如病毒是引起急性胃肠炎的主要食源性病毒，通过食入或接触诺如病毒污染的食品或物品而导致传染^[9]。牡蛎、贻贝等贝类消化腺组织中含有诺如病毒受体类似物，可从污染水体中富集高浓度病毒，因此，生食或食用加工不当的受污染贝类极易造成诺如病毒感染^[10]。甲型肝炎病毒是甲型肝炎的病原体，主要通过摄入被粪便污染的材料而感染。该病毒在十大食源性病原体中排名第六，已列入美国食品和药物管理局附录 V 中的严重危害列表^[11]。其他食源性病毒还包括戊型肝炎病毒、轮状病毒、冠状病毒、星状病毒、细小病毒等^[12]。

血液制品及组织修复材料是医疗救治中病毒性疾病传染的风险源。经血液制品传染的病毒主要有丙肝病毒（HCV）、乙肝病毒（HBV）、人类免疫缺陷病毒（HIV-1、HIV-2）、人类嗜T细胞病毒（HTLV）和细小病毒B19。临床应用中广泛使用的同种异体及异种组织修复材料，包括骨软骨修复材料、肌腱修复材料、脱细胞真皮、神经修复材料等。这些组织修复材料在生产及使用过程中，存在病毒无法检出、漏检或未知病毒污染等病毒性疾病传播的风险，如HBV、HIV、巨细胞病毒（CMV）、HCV以及狂犬病和朊病毒疾病。动物源性异种组织修复材料随着取材动物种类的增多，人兽共患疾病种类的风险也在不断加大，如口蹄疫、牛海绵状脑病、禽流感、重症急性呼吸综合征等^[13]。

2 电离辐射致病毒灭活的应用

虽然辐照灭菌对食品保存是有效的，但它对病毒的灭活有效性取决于病毒的大小、悬浮介质、食品特性和暴露温度。与高等生命形式相比，微生物对辐射具有更高的抵抗力，其中病毒对辐射的抵抗力最强。究其原因，可能与病毒区别于细菌等在大小、结构和生物特性方面的差异，如基因组类型与大小。病毒灭活滴度计算包括以半数细胞感染剂量（TCID₅₀）表示的终点稀释法病毒滴度计算法和以噬斑形成单位数（pfu）表示的噬斑法病毒感染滴度计算法。病毒平均灭活对数值为阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID₅₀或pfu）与试验（消毒）组平均病毒感染滴度（TCID₅₀或pfu）的对数之差。关于食品辐照，美国食品和药物管理局（FDA）允许的最大吸收剂量为4 kGy，而在欧洲最大允许剂量为10 kGy。然而，美国 FDA 批准的 4 kGy 剂量可能实现约1.0 log 病毒量的减少，对于大多数食品中病毒灭活率的进一步提升需要更大的辐照剂量才可实现。

2.1 食源性病毒的辐照灭活

食源性病毒事件中最常见的人类肠道病毒是诺如病毒和甲肝病毒。与病毒感染有关的最常见食物为绿叶蔬菜、新鲜水果和贝类。但也不局限于此，受污染的原料或新鲜农产品可作为多种食品配料，从而增加了病毒感染传播的可能性^[9]。因此在食品生产中应考虑食源性病毒的防控。

电离辐射用于提高食品的微生物安全性和保质期，对于细菌病原体非常有效，但有关其对食源性病毒影响的数据却很有限。多数研究围绕诺如病毒和甲肝病毒开展。Predmore等^[9]以人诺如病毒替代病毒杜兰病毒（TV）为研究对象，研究食品中杜兰病毒对电子线的辐照敏感性，进一步比较了杜兰病毒及鼠诺如病毒（MNV-1）对电子束辐照敏感性的差异，结果显示，在草莓和生菜中，16 kGy或更高剂量的电子束照射可使7 logs的杜兰病毒降低到无法检测到的水平；鼠诺如病毒比杜兰病毒的辐射抗性更强。Feng等^[14]对人类诺如病毒替代物鼠诺如病毒（MNV-1）、人类诺如病毒病毒样颗粒（VLP）和水疱性口炎病毒（VSV）的灭活情况进行了系统性研究。结果显示，MNV-1 和VLP对 γ 辐射具有一定辐射抗性。其中，5.6 kGy 辐射照射可致新鲜农产品中MNV-1减少1.7～2.4 logs；可致DMEM培养基中VSV减少3.3 logs。贝类是食源性病毒防控的关注食品，Praveen等^[15]评估了电子束照射致牡蛎中甲肝病毒和鼠诺如病毒的灭活效果。结果显示，将牡蛎的鼠诺如病毒和甲肝病毒滴度降低90%所需的照射剂量分别为4.05 kGy和4.83 kGy。Kim等^[16]开展电子束对鲍鱼中鼠诺如病毒灭活研究，发现随着照射剂量的增加，样品中病毒的活性明显降低，大于5 kGy的辐照剂量可杀灭鲍鱼内脏中90%以上的病毒。

此外，科研人员还积极尝试低能电子束在食品辐照领域的应用。利用其穿透能力弱的特点，期望达到对食品质量影响最小的情况下实现物品表面的消毒。Butot等^[8]利用高能电子束照射寻找肠道病毒的替代微生物，并以选定的替代微生物来研究低能电子束处理对冷冻蓝莓肠道病毒控制工业应用的可行性。结果推断16 kGy低能电子束照射冷冻蓝莓可使得甲肝病毒降低 1.4 logs，揭示低能电子束照射不能完全消除浆果病毒感染的风险。

2.2 生物制品病毒防控的辐照灭活

生物制品是指以微生物、细胞、动物或人源组织和体液为原料，应用传统技术或现代生物学技术制成，用于疾病预防、治疗和诊断的制品，包括：疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、诊断制品、微生态制剂等^[17]。针对生物制品的病毒防控，我国先后发布了《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》（2002版）、《动物源性医疗器械注册技术审查指导原则》（2017年修订版）、《同种异体植入性医疗器械病毒灭活工艺验证技术审查指导原则》（2020年修订版），明确要求血液制品、同种异体及动物源性医疗器械产品生产工序必须包括经过验证的病毒灭活工序。

2.2.1 血液制品中病毒的辐照灭活

血液制品是利用人血浆为原料，通过生物学工程技术制备的用于疾病治疗的生物活性制剂，如人纤维蛋白原、免疫球蛋白、人血白蛋白等^[17]。血液制品来源于人的血浆，存在携带病毒或污染病毒的风险，如生产过程中未对病毒去除或灭活，则可能造成病毒性疾病的传播。根据《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》规定，为提高血液制品安全性，生产工艺要具有一定的去除/灭活部分病毒能力，生产过程中应有特定的去除/灭活病毒方法。指导原则中提出了针对血液制品病毒灭活指示病毒、灭活方法、验证及结果判定等，但并未涉及电离辐射的灭活方法。电离辐射具有穿透性强、病毒灭活彻底等优点，适用于血制品的病毒灭活处理。Kitchen等^[18]研究了γ射线辐照对人类免疫缺陷病毒和血浆凝血因子的影响，结果显示，γ 射线可有效灭活人类免疫缺陷病毒，同时存在凝血因子活性丧失的现象，但凝血因子活性丧失率远低于病毒感染性丧失率。Miekka等^[19]在25%人血清白蛋白溶液中加入猪细小病毒（PPV）、脑心肌炎病毒（EMCV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛痘病毒4种病毒，探索在保持人白蛋白生物活性前提下实现辐照对病毒的灭活。发现50 kGy的辐射照射可灭活病毒3.2～6.4 logs，而白蛋白仅适度聚集和碎片化。

2.2.2 同种异体组织修复材料中病毒的辐照灭活

同种异体组织修复材料存在捐献供体携带病毒未筛查出或后期污染而存在病毒疾病传播的风险。因此，组织修复材料加工处理工艺中设置病毒灭活操作环节是必要的。Knaepler等^[20]发现15 kGy可灭活同种异体松质骨人类免疫缺陷病毒。Fideler等^[21]利用20～40 kGy的γ射线对新鲜冷冻骨移植物中人类免疫缺陷病毒进行灭活研究，发现20～25 kGy辐射照射不能有效破坏人类免疫缺陷病毒基因，当剂量达到30～40 kGy时，病毒基因被完全破坏。其建议新鲜冷冻骨移植物辐照灭菌剂量为30 kGy或更高剂量。Campbell等^[22]在干冰保存条件下（约−70℃），用0～40 kGy γ 射线照射HIV病毒，结果显示，灭活同种异体骨中的HIV生物负载所需剂量为35 kGy。若达到10⁻⁶无菌保证水平所需剂量为89 kGy。Moore^[23]探究低温条件下辐照处理对人肌腱和皮质骨样本中病毒灭活的影响，分别给于低温条件下接种病毒的肌腱和骨骼 γ 射线照射，剂量分别为11.6～12.9 kGy 和 11.6～12.3 kGy。结果显示，照射后肌腱中人类免疫缺陷病毒减少至少2.90 logs，猪细小病毒减少1.90 logs，伪狂犬病病毒减少3.80 logs，牛病毒性腹泻病毒减少2.57 logs，甲型肝炎病毒减少2.54 logs；骨骼中人类免疫缺陷病毒减少至少3.20 logs，猪细小病毒减少1.58 logs，伪狂犬病病毒减少3.79 logs，牛病毒性腹泻病毒减少4.56 logs，甲型肝炎病毒减少2.49 logs。上述数据表明，低温条件下对同种异体组织进行终末灭菌的过程可以灭活有包膜和无包膜的 DNA 或 RNA 病毒。赵彦涛等^[24]对浸泡有伪狂犬病毒（PRV）、水泡性口炎病毒 （VSV）、猪细小病毒（PPV）、猪脑心肌炎病毒（EMCV）、人免疫缺陷病毒（HIV-1）的同种异体肌腱进行病毒辐照灭活效果研究，同时检测辐照对材料力学性能的影响。结果表明，经过 γ 射线辐射照射可使沾染在同种异体肌腱上的病毒滴度下降超过 4 logs，且盲传 3 代无病毒检出。辐照前后，同种异体肌腱极限拉伸载荷和组织结构差异无统计学意义，提示 25 kGy 终末辐照灭菌是同种异体肌腱病毒灭活的有效方法。刘思扬等^[25]研究⁶⁰Co辐照法对生物羊膜中污染的人免疫缺陷病毒（HIV-1）灭活效果，结果显示，25 kGy γ 射线辐射照射可使污染在生物羊膜制品的HIV-1 ⅢB病毒滴度下降至少6.5 logs。处理后生物羊膜制品经细胞培养盲传3代，均未出现细胞病变。

2.2.3 动物源异种组织修复材料中病毒的辐照灭活

动物源性组织修复材料主要来源于猪、牛、马、鼠、海洋生物等组织，如脱细胞基质、表皮、真皮、心包、神经等。其具有良好的生物相容性和组织诱导活性，广泛应用于临床缺损组织器官的修复。由于取材来源，该类组织修复材料存在动物源性病毒携带传播的风险，需从来源及加工两方面进行病毒风险控制，确保临床使用安全性^{[13, 26]}。Lee等^[27]研究发现，经25 kGy辐照后牛细小病毒（BPV）、牛疱疹病毒（BHV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛副流感病毒（BPIV-3）的病毒滴度下降均超过5 logs。王建锋等^[28]对染有伪狂犬病毒的猪来源板层角膜进行辐射照射，发现10 kGy辐照产品已检测不到病毒，10、15、20、25 kGy辐照样品盲传3代未检出病毒。张伟等^[29]研究显示，25 kGy γ射线可灭活脱细胞猪心包膜上负载的CVB3、PRV、BVDV、PPV病毒。蒋丽霞等^[30]发现25 kGy辐射照射对牛跟腱来源胶原蛋白海绵中负载指示病毒VSV、TEMV、PRV、SV40的降低系数均大于4 logs。方哲翔等^[31]以水疱性口炎病毒（VSV）、伪狂犬病病毒、呼肠弧病毒Ⅲ（Reo 3）、PPV作为指示病毒，将医用胶原修复膜中间品进行⁶⁰Co γ 射线辐照，检测病毒灭活/去除效果。结果显示，经25 kGy 剂量⁶⁰Co γ 射线辐照处理后，样品中VSV、PRV、Reo3 和PPV 均被有效灭活，病毒灭活值分别为5.64、4.35、4.87 和5.36 logs。Cusinato等^[32]评估了过氧化氢处理和电子束照射对掺入柯萨奇病毒 B1、流感病毒 A 型、H1N1 亚型和单纯疱疹病毒 1 型3种病毒的马源性异种移植物病毒灭活效果。结果显示，25 kGy 的电子束照射能有效降低病毒量超过4 logs，但单独的电子束照射在减少生物材料中病毒基因组载量方面效果较差。陈强等^[13]对吸附有指示病毒猪细小病毒、猪伪狂犬病毒（PRV）、柯萨奇3型病毒（CVB-3）和牛病毒性腹泻病毒动物源性医疗器械产品胸普外科修补膜进行病毒灭活有效性的验证，结果显示，经1%NaOH 溶液浸泡或25 kGy ⁶⁰Co γ射线辐照单一工艺处理后病毒滴度降低都超过4 logs，2种工艺合用处理后病毒滴度降低超过6 logs。段晓杰等^[33]开展次氯酸钠溶液和⁶⁰Co γ射线辐照对脱细胞结膜基质中病毒灭活效果的研究，结果显示，用次氯酸钠溶液和⁶⁰Co γ射线辐照2个工艺分别处理脱细胞结膜基质后的病毒灭活降低系数累加为：牛病毒性腹泻病毒（BVDV）总降低系数大于8 logs，猪细小病毒总降低系数大于9 logs。2个工艺联合可有效灭活猪源脱细胞结膜基质中污染的猪细小病毒和牛病毒性腹泻病毒。

2.2.4 病毒灭活疫苗的制备

疫苗接种作为20世纪公共卫生重大成就，是各国医疗卫生的重要国策。我国疫苗应用发展为消灭天花、脊髓灰质炎等传染病做出了重大贡献^[34-35]。由 SARS-CoV-2 引发的 COVID-19 已演变为全球大流行，并造成了前所未有的健康危机，接种疫苗是预防控制COVID-19最有效的措施之一，是降低发病率和死亡率的关键。其中，灭活疫苗一直是疫苗的重要研发方向，其制备方法包括化学与物理等多种制备工艺，电离辐射技术是灭活疫苗制备工艺之一。与福尔马林和紫外线灭活等制备工艺相比，γ 射线辐射照射制备的灭活疫苗对病毒蛋白质完整性的影响最小。γ射线制备灭活疫苗时，可在深度冷冻状态下完成病毒的辐射照射，进而最大限度地减少由于水的辐射分解引起的自由基带来的氧化损伤^[36-37]。Karakus等^[36]使用γ 射线灭活的SARS-CoV-2 疫苗（OZG-3861-01）在BALB/c小鼠体内可诱导具有中和能力的抗体产生，并且未观察到抗体依赖增强效应。Turan等^[38]利用γ辐射照射获得了灭活的SARS-CoV-2 疫苗（OZG-38.61.3），并完成了相关检测实验。此外，低能电子束是病毒灭活疫苗制备的新方向。Fertey等^[39]证实，与福尔马林类似物相比，接种低能电子束灭活的甲型流感病毒（H3N8）的小鼠可产生强大的保护作用，肺部的保护作用显著减少。Bayer等^[40]对低能电子束灭活呼吸道合胞病毒进行了评估，发现低能电子束灭活疫苗免疫小鼠能起到有效保护作用。

2.3 高风险病毒实验室检测样品制备

一些高风险病毒，如中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、重症急性呼吸综合征冠状病毒SARS-CoV、SARS-CoV-2等，要求必须在生物安全防护三级实验室（BSL-3）及生物安全性更高的实验室操作，但许多用于表征病毒特征和评估病毒感染动物样本的过程和程序在 BSL-2 或更低的防护等级下更容易实现。因此，为完成高风险病毒在BSL-2实验室的操作，高风险病毒在进入BSL-2实验室前需要进行灭活。此外，辐照灭活是用于各种血清学、免疫学和生化分析标本的首选方法^[41]。Kumar等^[42]评估了在较低生物防护水平实验室处理标本之前灭活病毒的典型方法，其中涉及辐照灭活方法。结果显示，10 kGy γ射线辐射照射可使MERS-CoV滴度降低4～5 logs，20 kGy足以完全灭活空斑试验所确定的病毒。Haddock等^[41]发现10 kGy的γ射线可完全灭活SARS-CoV-1和SARS-CoV-2。Feldmann等^[43]选择拉沙病毒（LASV）、裂谷热病毒 （RVFV）、重症急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、蜱传脑炎病毒（TBEV）、甲型流感病毒（H5N1）、埃博拉病毒（EBOV）、马尔堡病毒（MARV）、亨德拉病毒（HeV）、尼帕病毒（NiV），探讨γ射线辐射照射致病毒的灭活，结果显示，载量为1×10⁶ TCID₅₀/mL的SARS-CoV灭活剂量为10 kGy；载量为1×10⁶ TCID₅₀/mL的LASV、RVFV、HeV、NiV 和 H5N1灭活剂量为40 kGy；载量为1×10⁶ TCID₅₀/mL的TBEV灭活剂量为50 kGy。考虑到2倍安全系数，建议载量1×10⁶ TCID₅₀/mL的不同病毒的灭活剂量为：冠状病毒科为20 kGy；丝状病毒科为40 kGy；沙粒病毒科、布尼亚病毒科、正粘病毒科和副粘病毒科均为80 kGy；黄病毒科为100 kGy；上述结果也表明包膜病毒对γ射线的敏感性不同，其灭活剂量与基因组大小呈负相关。

3 新冠肺炎疫情防控下电离辐射技术应用的思考

生物安全作为国家安全的重要组成部分受到各国的普遍重视，如烈性传染病所带来的生物安全问题。过去十几年，SARS-CoV及MERS-CoV感染引起的呼吸道传染病的流行，使冠状病毒成为21 世纪新的公共卫生问题^[44]。2019年以来，由SARS-CoV-2引发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）已呈现全球大流行。应对新冠肺炎疫情防控，辐照技术在口罩和医疗物资生产、医疗垃圾和废水处理等领作出了突出贡献。结合电离辐射致病毒灭活作用及其应用研究，提出以下思考。

1）针对新冠肺炎疫情防控中冷链食品频发SARS-CoV-2感染事件及物流包裹存在SARS-CoV-2传播风险，积极推进冷链食品新冠病毒辐照消毒技术科研攻关及技术应用；同时建立完善的食品辐照溯源体系及质控体系。

2）为应对未来可能发生的未知病毒传播风险，扩大辐照致病毒灭活研究及应用领域，建立针对不同种类病毒辐照灭活的剂量数据库。

3）鉴于低能电子束与高能电离辐射的差异，积极推进低能电子束在辐照灭活病毒方面的研究及应用，同时推动自屏蔽低能射线消毒装置及应用研发。

4）考虑病毒传播与物流的关系，建议未来国家及地区进行辐照设施规划时考虑海关、物流枢纽等区域位置的选择。