目前，对辐射暴露人员的损伤评估主要采用常规临床检查，特殊体检包括染色体和微核分析^[1-2]，但这些指标不能有效的发现辐射所致的早期损伤。随着分子生物学技术的发展，已发现多种辐射敏感的分子指标，而这些研究主要集中在动物模型、细胞模型层面上^[3-5]，应用到人的辐射损伤评估，有一定的距离。miRNA是一组内源性非编码RNA，广泛存在于真核生物中，在细胞增殖、分化、凋亡及基因调控中起重要作用^[6]。因此本研究通过检测不同剂量电离辐射作用后健康成年人外周血miRNA表达变化情况，初步筛选出辐射敏感的分子，为进一步研究辐射早期损伤评估技术提供实验基础。

1 材料与方法 1.1 研究对象

选取健康成年男性7人，20～35周岁，近6个月内无放射线接触史，无吸烟和饮酒史，采用肝素钠抗凝管现场每人采集静脉血5 ml。

1.2 照射方式及分组

在中国辐射防护研究院放疗科照射，采用⁶⁰Co远距离治疗机（型号是：GWGP80，生产厂家：中国核动力研究设计院设备制造厂），源皮距为80 cm，照射剂量率为0.50 Gy/min，照射野直径20 cm × 20 cm，辐照剂量分别为0.2 Gy和2.0 Gy，并设假照组。

1.3 miRNA测序、验证

不同剂量照射后6 h，采用试剂盒提取miRNA，miRNA测序委托上海康成生物有限公司进行，miRNA测序具体实验过程：样品经琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop进行质检定量，构建好文库，用Agilent 2100 Bioanalyzer进行文库质量测定，混合好不同样品的测序文库，通过0.1 M NaOH变性生成单链DNA，在IlluminaNextSeq 500 测序仪上进行51个循环。测序所得数据经质控后进行后续数据分析；设定阈值为1.5倍差异（p ≤ 0.05），来筛选差异表达的miRNA。

1.4 部分miRNA表达水平的验证

选取不同剂量共同差异的miRNA分子进行RT-PCR验证，miRNA引物如表1中所示。

1.5 差异靶基因的功能和通路富集分析

采用靶基因生物预测数据库mirdbV6和Target Scan7.1预测差异miRNA的靶基因，并筛选两个数据库的交集，以此作为候选的目的靶基因。采用京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）对靶基因参与的生物途径进行富集分析。

1.6 统计学方法

采用Student t检验（两组间）和方差分析（多组间）进行数据处理，P <0.05，代表差异有统计学意义，所有数据均来源于独立的至少重复3次的实验结果。

2 结果 2.1 不同剂量γ射线作用后人外周血差异miRNA基因表达的变化

不同剂量电离辐射作用后6 h，差异miRNA的表达情况是不同的。与对照组相比，0.2 Gy γ射线作用后，显著差异miRNA共有10个，上调2个，下调8个。2.0 Gy照射后，共有21个差异miRNA，上调9个，下调12个，提示辐射敏感的miRNA数量随着照射剂量的增加而增多，表2所示为各组显著上调的前5个分子表达变化情况，其中hsa-miR-23c、hsa-miR-1287-5p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-6511b-3p、has-miR-320d分子在两个剂量组均发生显著变化。

2.2 显著差异miRNA分子的验证

选择在两个剂量组共同发生显著变化（变化倍数 > 1.5，P < 0.05）的5个差异miRNA进行RT-PCR验证，结果如 图1所示。5个miRNA变化趋势与测序结果一致，除hsa-miR-6511b-3p-2 在0.2 Gy组中，与对照组相比无显著差异，其余4个在两个剂量组均有统计学意义，且变化倍数大于1.5倍，分别为miR-23c、miR-1287-5p、miR-219a-3p、miR-320d。验证结果和miRNA测序结果有较高的符合率，说明测序数据可用于进一步的功能分析。

2.3 共同差异miRNA的靶基因功能分析

通过mirdbV6和Target Scan7.1数据库预测共同差异miR-23c、miR-1287-5p、miR-219a-3p、miR-320d的靶基因，如图2所示两个数据库中共有的靶基因311个，进一步对靶基因进行显著性通路分析，发现这些靶基因主要富集于与细胞增殖、凋亡和DNA 修复及免疫调控作用有关的MARK、RAS、P53、RIG-I等信号通路。

3 讨论

随着核技术的不断发展，其在工业、农业、医学及研究领域的广泛应用，电离辐射的健康危害成为社会关注焦点。尤其是在发生核辐射突发事件时，能及时、有效地对潜在暴露人员进行剂量估算指导伤员的分类诊断，对于提高应急救援能力、维护社会稳定具有重要意义^[7]。电离辐射主要通过诱导机体产生大量自由基，引起多个分子通路基因的改变，影响细胞增殖、细胞周期调控、DNA损伤修复和细胞凋亡等生物学反应，从而导致机体多系统损伤。目前对辐射损伤的评估往往依赖于临床症状（呕吐）、淋巴细胞计数、细胞遗传学分析等手段，但这些方法均存在一定的局限性，如呕吐易受到心理因素影响，使剂量估算的误差率高达190%；淋巴细胞计数在正常人本底值差异较大，易出现假阳性或假阴性；细胞遗学分析技术，实验耗时长达72 h，对技术人员要求高，过程较为繁琐复杂，并且目前这些检测技术对于低剂量电离辐射的损伤的敏感性较差，因此不利于辐射损伤的早期诊断^[8-9]。

生物学技术的发展，使得我们有条件应用分子学技术进行辐射损伤的研究。miRNA是一类由内源基因编码的长度约22个核苷酸的非编码单链RNA分子，主要以碱基互补方式与靶基因mRNA的3′非翻译区特异性结合，通过降解mRNA或抑制蛋白翻译合成而实现对靶基因的转录后调控，广泛存在于真核生物中，在细胞增殖、分化、凋亡及基因调控中起着重要作用。人类体液中miRNA耐酸、耐碱、物理性质非常稳定，很适合作为一种生物标志物^[10-11]。本研究采用miRNA测序技术筛选γ射线作用后6 h人外周血中差异表达的miRNA，旨在发现辐射损伤早期敏感的miRNA分子。结果发现，0.2 Gy组差异miRNA有10个，2.0 Gy组共有21个差异miRNA。这一结果与Molykutty等研究经不同剂量照全身照射大鼠后6 h的miRNA表达变化趋势一致^[12]。李刚强^[13]等研究年受照剂量不同的介入工作人员中差异表达的miRNA分子，同样发现随着剂量增加差异miRNA分子数量是增加的，这可能与较大照射剂量激活更多的信号通路，诱导更严重的损伤有关。此外本研究结果发现miR-23c、miR-1287-5p、miR-219a-3p、miR-320d分子表达在两个剂量组均发生显著的变化，提示这4个miRNA分子有望作为辐射损伤的早期诊断指标。

电离辐射会导致细胞凋亡、DNA损伤、抑制免疫系统和造血系统、细胞向癌细胞转化等^[5]。通过对本研究发现的共同差异miRNA靶基因生物信息学功能的分析，也发现调控的靶基因主要富集在与细胞增殖、凋亡、DNA损伤修复及免疫调控等过程相关的MARK、RAS、P53、RIG-I等信号通路。这与文献报道^[14]，电离辐射作用后小鼠空肠转录组差异基因主要富集于DNA损伤修复通路、P53信号通路的结果是相一致的。但这些通路中，具体哪些基因在人外周血受照后发挥作用，在不同剂量电离辐射作用后激活的基因是否一致，还需要进一步的研究。

综上所述，本研究通过对人外周血照射后差异miRNA表达的分析，初步探讨了不同剂量电离辐射作用后差异表达的miRNA分子的表达变化情况，并对其靶基因功能进行了分析，筛选出miR-23c、miR-1287-5p、miR-219a-3p、miR-320d有望作为辐射早期损伤的检测指标，这些miRNA的靶基因主要参与细胞增殖、凋亡、DNA损伤修复及免疫调控等过程，为深入研究miRNA在辐射损伤中的调控机制提供参考。