水蛭为水蛭科动物蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)、水蛭(Hirudo nipponica Whitman)或柳叶蚂蟥(Whitmania acranulata Whitman)的干燥全体，主要用于血瘀经闭、癥瘕痞块、中风偏瘫、跌扑损伤等^[1]。水蛭中含有多种肽类及胺类物质^[2]，临床应用众多。近期研究表明，水蛭在心脑血管病变、脏腑纤维化、子宫内膜异位、血管性痴呆等疾病的治疗中均发挥了关键作用^[3-7]。现有多种中成药以水蛭生粉入药，然而，由于水蛭的水生生活环境以及贮藏过程中易霉变^[8]，导致以水蛭生药粉入药的中成药的卫生学指标难以控制，其药材细粉在固体制剂中微生物超标严重，极大地限制了相关中成药的药理药效的研究及临床应用，因此，控制水蛭药材质量的重要性愈发凸显^[9-10]。为保证含水蛭生粉入药的中成药的临床用药安全性，所以对水蛭药粉中的微生物含量的控制尤为重要。

目前，辐照射线常用于医学诊断及治疗领域，是治疗肿瘤的主要手段之一，引领“精确放疗”时代^[11-13]。

中药药材饮片普遍的灭菌方法^[14]包括：水洗灭菌法、化学灭菌法、热压灭菌法和射线灭菌法等，其中水洗灭菌法适用药材的初步处理，去除药材表面菌；化学灭菌法使用化学试剂，所得灭菌后药材会有化学残留；热压灭菌法包括干热灭菌法和湿热灭菌法，二者温度较高，适用于植物药材饮片灭菌，但不适用于动物药材灭菌，容易造成动物药材蛋白变性影响后面有效成分提取；射线灭菌法包括辐射灭菌法、紫外线灭菌法和微波灭菌法，紫外灭菌法适用于空气灭菌和表面灭菌，微波灭菌法适用于植物药材饮片灭菌，不适合动物药材灭菌，易造成蛋白变性，⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌法，是药材灭菌中一种新型、高效的灭菌方法，其灭菌特点操作简单，穿透能力强，速度快，可在常温下进行，尤其是对含热敏性成分药材的灭菌有重要意义，具有灭菌彻底、无污染、无残留等优势^[15]。⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌法于多种中药材饮片的灭菌中进行应用^[16-17]，如黄精、地黄、龙胆、黄岑、天南星等^[18-19]，以及蜈蚣、蝉蜕等动物药也有应用^[20]，灭菌效果显著。本实验采用⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌法对直接粉碎入药的水蛭生药粉进行辐照灭菌，以确定不同剂量⁶⁰Co-γ射线辐照对水蛭药粉质量的影响，确定最佳灭菌剂量，对水蛭药粉灭菌工艺提升提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

高效液相色谱仪（1260，安捷伦科技有限公司），粉碎机，超净工作台（JD-CJ-1A），生化培养箱（BJPX-200型），电子分析天平（ME1002，METTLER TOLEDO），80目药筛。

胰酪大豆胨琼脂（批号：EP1812027）、沙氏葡萄糖琼脂（批号：EP1812027）、铜绿假单胞菌（cmcc（B）10104）、大肠艾希菌（cmcc（B）44102）、乙型副伤寒沙门菌（cmcc（B）50094）；高效液相使用试剂为色谱纯，其余所用试剂均为分析纯。

水蛭购于扬州，经鲁南厚普制药有限公司质检中心鉴定，为水蛭科动物水蛭（Hirudo nipponicaWhitman）的干燥全体，符合《中国药典》2015年版药材水蛭项下来源规定，将上述水蛭药材粉碎，过80目药筛，保存备用。

1.2 方法 1.2.1 辐照剂量研究

称取水蛭药粉15份，每份200 g，以无菌自封袋密封，分别编号1～15，分为5组进行试验；1～3号无操作，为阴性对照组，其余12份分别以4、6、8、10 kGy的⁶⁰Co-γ射线进行动态辐照操作，为实验组。

1.2.2 药典检查项指标测定

按《中国药典》2015年版水蛭项下要求，对经不同剂量的⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌的水蛭药粉进行水分、总灰分、酸不溶性灰分、pH值、重金属及有害元素、黄曲霉毒素和抗凝血酶指标测定。

1.2.3 卫生学指标测定

对经不同剂量的⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌的水蛭药粉进行微生物含量的卫生学指标测定，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数照《中国药典》2015年版四部通则1105“非无菌产品微生物限度检查；微生物计数法”检测，控制菌照《中国药典》2015年版1106“非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”检测。

1.2.4 化学成分图谱的测定

对经不同剂量的⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌的水蛭药粉进行高效液相化学成分测定，检测方法参照刘武占等^[21]研究中，对水蛭中尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺A、水蛭胺B 7种成分同时测定的方法。

2 结果 2.1 辐照剂量研究

经观察，不同剂量的⁶⁰Co-γ射线辐照的水蛭药粉，灭菌前后外观性状无明显差异，棕红色，腥气重。5个试验组水蛭药粉形态、颜色、气味均一稳定。

2.2 药典检查项指标测定

按《中国药典》2015年版水蛭项下要求，对经不同剂量的⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌的水蛭药粉进行指标测定，测定结果见表1。

2.3 卫生学指标测定

对经不同剂量的⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌的水蛭药粉进行微生物含量的卫生学指标测定，需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数及微生物限度检查测定结果见表2。

2.4 化学成分图谱的测定

对经不同剂量的⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌的水蛭药粉进行高效液相化学成分测定，液相色谱图见图1。

从图1可以看出，⁶⁰Co-γ射线辐照各组（≤ 10 kGy）对水蛭生药粉的HPLC指纹图谱与阴性对照组指纹图谱所含成分基本一致，水蛭中7个有效成分尿嘧啶保留时间为8.352 min、次黄嘌呤保留时间为14.997 min、黄嘌呤保留时间为18.084 min、尿苷保留时间为19.883 min、水蛭胺C保留时间为30.926 min、水蛭胺A保留时间为31.512 min、水蛭胺B保留时间为37.169 min,各有效成分保留时间无明显差异，表明经过辐照灭菌后水蛭中未有成分增加或减少变化。

对5组不同辐照剂量（0、4、6、8、10，kGy）水蛭药粉化学成分液相图谱进行分析，分别将尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺A、水蛭胺B 7种成分的峰面积与阴性对照组的7种成分的峰面积进行对比计算（公式：比值 = A_试验组 ÷ A_{阴性对照组}），比值结果见表3。

3 讨论 3.1 不同辐照剂量水蛭药粉药典检查项测定结果分析

从表1可以看出，不同辐照剂量水蛭药粉水分值有轻微减少，当辐照量为10 kGy时最低，为9.6%；总灰分值为未经辐照操作的药粉含量最高，比辐照后的水蛭药粉总灰分平均值高9%，酸不溶性灰分无明显差异；5个试验组水蛭药粉酸碱度均处于6左右；重金属及有害元素中，铅元素含量最高为6 kGy、10 kGy辐照剂量时，为5.1 ppm，最低为4 kGy辐照剂量时的4.8 ppm，差值为0.30 ppm，其余金属元素除砷元素含量最大值与最小值为0.30 ppm，5个实试验组的镉元素含量、汞元素含量差值在0.1 ppm左右；未经⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌的阴性对照组中黄曲霉毒素含量最高，为0.005 8 ppm，比辐照灭菌后的含量最低值（6 kGy辐照试验组）高出20%；不同辐照剂量试验组水蛭药粉抗凝血酶无明显差异。⁶⁰Co-γ射线辐照（≤ 10 kGy）灭菌前后水蛭药粉中的水分、总灰分、酸不溶性灰分、酸碱度、重金属、黄曲霉素和抗凝血酶含量4个试验组与阴性对照组虽存在差异，但各指标均仍符合2015版《中国药典》项下限度要求，灭菌前后药粉质量稳定性良好。

3.2 不同辐照剂量水蛭药粉卫生学指标测定结果分析

由表2可以知道，未经⁶⁰Co-γ射线辐照的阴性对照组需氧菌总数为18 000 cfg/g，霉菌和酵母菌总数为1 600 cfg/g，耐胆盐革兰氏阴性菌个数大于100 cfg/g，远超过药典限度标准，而经4 kGy以上辐照剂量灭菌的试验组需氧菌总数急剧降低，其中4 kGy辐照剂量试验组较阴性对照组减少了20倍，当辐照剂量增加时，需氧菌总数与辐照剂量呈反比降低，辐照剂量增加至10 kGy时，需氧菌总数为降至10 cfg/g；霉菌和酵母菌总数在接受⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌后总数比阴性对照组降低了18倍，继续增加辐照剂量，霉菌和酵母菌总数持续降低，直降至10 cfg/g以下；耐胆盐革兰氏阴性菌由大于100 cfg/g接受4 kGy辐照灭菌后减少至小于10 cfg/g，其余辐照剂量检测的耐胆盐革兰氏阴性菌均小于10 cfg/g；试验过程中无论是否接受⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌，均未检出大肠埃希菌与沙门菌。依照非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物标准，经4 kGy以上辐照剂量灭菌的试验组微生物限度均符合含生药粉口服固体制剂卫生学标准，但综上分析，在辐照剂量0～10 kGy中，8 kGy或8 kGy以上剂量辐照灭菌效果最佳。

3.3 不同辐照剂量水蛭药粉化学成分图谱分析

如表3所示，不同剂量⁶⁰Co-γ射线辐照后水蛭中尿嘧啶与阴性对照组峰面积之比为1.00～1.04、次黄嘌呤与阴性对照组峰面积之比为0.99～1.03、黄嘌呤与阴性对照组峰面积之比为1.03～1.08、尿苷与阴性对照组峰面积之比为0.96～1.02、水蛭胺C与阴性对照组峰面积之比为0.97～1.00、水蛭胺A与阴性对照组峰面积之比为0.87～1.08、水蛭胺B与阴性对照组峰面积之比为1.02～1.10，7个成分的峰面积之比均接近1，7个成分含量灭菌前后均无明显差异。

3.4 结论

本实验对不同剂量⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌对水蛭药粉质量的影响进行了研究，研究发现水蛭药粉接受4～10 kGy剂量⁶⁰Co-γ射线辐照后，颜色、气味、外观形态以及药典检查项和化学成分液相图谱等方面较灭菌前均无明显差异，说明⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌对水蛭药粉质量无明显影响；但水蛭药粉接受⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌后，微生物含量差异明显，当辐照剂量为8 kGy及8 kGy以上时灭菌效果最佳，此时水蛭的各项理化指标均符合药典项下水蛭的要求；参考国家食品药品监督管理局发布的《中药辐照灭菌技术指导原则》（2015年第86号），中药最大总体平均辐照剂量不超过10 kGy，确定8～10 kGy的⁶⁰Co-γ射线辐照灭菌为水蛭药粉的灭菌剂量。但辐照后的残留有待进一步研究。