2. 广东医科大学
2. Guangdong Medical University
联合国辐射效应科学委员会(UNSCEAR)2010年最新公布低剂量电离辐射(low-dose ionizing radiation, LDR)是指外照射剂量低于200 mGy或剂量率低于0.1 mGy·min−1(1 h以内或1 h以上的平均剂量率)的X或γ射线[1]。随着人类对核能的开发和利用越发普遍,如核电站的运行、X光检查及各种放射治疗等,大众接触LDR的机会和频率也不断增多。相关研究表明LDR对人类健康存在潜在影响,其对人类健康效应的影响成为国内外研究的焦点[2-5]。电离辐射可通过直接作用于DNA分子引起DNA单链或双链断裂损伤或通过产生活性氧自由基(ROS)间接对DNA分子造成氧化损伤[6-7]。其中,8-羟基脱氧鸟苷是电离辐射造成DNA分子氧化损伤的主要产物,人8-羟基脱氧鸟嘌呤DNA糖苷酶-1(human 8-hydroxydeoxyguanine DNA glycosidase,hOGG1)可特异性识别并切除8-羟基脱氧鸟嘌呤,修复氧化损伤的DNA。O6 - 甲基鸟嘌呤 - DNA- 甲基转移酶(O6- methylguanine- DNA methyltransferase,MGMT)是目前发现的人类细胞中唯一能修复O-6-甲基鸟嘌呤损伤的甲基转移酶,可以修复细胞中烷化剂所致的DNA损伤。蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)是一个潜在的肿瘤抑制因子,可使磷酸化的蛋白发生去磷酸化,进而影响其目标蛋白活性及相应的信号通路活性,调节细胞的物质代谢、细胞分裂、细胞转化及细胞凋亡等几乎所有的生理和病理过程[8-9]。相关研究表明,PP2A参与了DNA损伤时DNA双链断裂的修复蛋白磷酸化组蛋白H2AX的去磷酸化,诱导细胞周期检查点的激活,阻滞细胞周期的进行,利于细胞充分修复损伤的DNA,在DNA的损伤修复中起着重要的作用[10]。基于上述研究背景,本研究选择人外周血淋巴细胞作为研究对象,探讨不同剂量电离辐射对DNA损伤修复酶相关基因(hOGG1、MGMT、PPP2R1A、PPP2R2D)转录水平的影响及其修复DNA损伤的能力,为LDR诱导兴奋效应或适应性反应提供实验基础,进一步为长期LDR暴露作业人员的健康风险评估提供科学依据。
1 对象和方法 1.1 研究对象以1名25岁健康男性志愿供血者为研究对象,检查前1周内均未服用任何药物,3个月内均未接受职业或医疗照射,无化学毒物接触史,无急慢性疾病,无烟酒嗜好。本研究实施前经广东省职业病防治院医学伦理委员会批准,所有供血者均签署了知情同意书。
1.2 方法 1.2.1 血样采集及血细胞的离体辐照抽取1名志愿者外周静脉血约30 mL,分置于7支肝素锂抗凝管中,每支管约4 mL。依据GBZ215—2009《过量照射人员医学检查与处理原则》对人外周血进行60Co γ辐照处理,辐射剂量分别设为0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 Gy 共7组,剂量率为0.38 mGy·min−1,血样按照设计剂量于室温(25℃)条件下进行辐照。
1.2.2 血样本中淋巴细胞分离和培养取经60Co γ辐照后的血液样品,采用密度梯度离心法分离淋巴细胞。先将抗凝全血与等体积的PBS溶液充分混匀,然后轻轻移入预先加有5 mL淋巴细胞分离液的50 mL离心管中。2 000 rpm (800 g)离心30 min,小心吸取血浆层和淋巴细胞分离液层中间混悬白色云雾状层(淋巴细胞)到新的50 mL离心管内,加入PBS到25 mL,1 500 rpm(600 g),离心10 min。吸弃上清,用20 mL PBS重悬细胞。750 rpm(300 g),离心10 min。吸除上清,用含双抗(青霉素100 U/mL,链霉素100 μg/mL)的RPMI-1640完全培养基重悬细胞,并转移入细胞培养皿中。将细胞置于37℃、5%CO2、95%饱和湿度的恒温培养箱中培养12 h后抽提细胞总RNA。
1.2.3 淋巴细胞中hOGG1、MGMT、PPP2R1A、PPP2R2D基因转录水平检测 1.2.3.1 总RNA提取、定量和纯度测定采用Trizol法提取淋巴细胞总RNA,用微量紫外分光光度计Q5000对RNA在260 nm下的吸光度进行定量和纯度测定。①RNA纯度的测定:样本吸光度比值要求在1.7 < OD 260/OD280 < 2.0。②RNA完整性的测定:在凝胶成像系统下观察RNA的电泳带,比较核糖体RNA(rRNA)28S和18S两条带,判断RNA完整性。
1.2.3.2 引物的设计与合成从基因银行(GenBank)获得目的基因mRNA的全长序列,利用引物设计软件Primer 5.0设计引物序列。经过Blast分析,引物序列具有特异性。引物均委托北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。所用的引物及内参照GAPDH引物序列如表1所示。
以总RNA为模板,使用逆转录试剂盒(invitrogen,美国)进行cDNA的合成。按照操作步骤,取DEPC处理的PCR管,在PCR管中配置逆转录反应液(在冰浴中进行),然后在PCR仪上进行逆转录反应,逆转录反应条件为:30℃ 10 min,42℃ 60 min,99℃ 5 min,4℃ 5 min,反应结束后的产物贮于−20℃备用。
1.2.3.4 实时荧光定量PCR反应体系:反转录产物cDNA 1.0 µL,各基因上游与下游引物各0.25 µL,12.5 µL PCR反应预混液(AmpliTaqGold® FastDNAPolymerasLD,10 × buffer,SYBR® Green1,dNTPs),用ddH2O水补足体积至25µL。混匀后立即置于PCR仪中进行反应。PCR条件为:94℃ 2 min;94℃ 30 s,62℃30 s,72℃ 30 s,进行35个循环;最后72℃ 延伸10 min。PCR反应结束后的样品保存于–20℃备用。取PCR产物3~5 μL进行琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统下观察PCR产物的电泳带。
1.2.3.5 特异性分析在ABI-7500实时荧光定量PCR仪上选定溶解曲线程序,连续收集样品的荧光信号以获取融解曲线,检测试验反应的特异性,排除非特异性扩增和引物二聚体的干扰因素。
1.2.3.6 统计学分析实时荧光定量PCR反应所得结果以Ct值表示,采用ΔCt=Ct目的基因–CtGAPDH,ΔΔCt=ΔCt实验组−ΔCt对照组,计算ΔΔCt后,再计算2−ΔΔCt。以基因相对表达水平2−ΔΔCt值计算各目的基因相对转录表达水平,采用SPSS19.0对数据进行处理和分析。计量资料以
本研究提取的外周血淋巴细胞总RNA OD260/OD280范围1.84~1.99,浓度范围115.5~423.2μg/μL。RNA电泳显示28s rRNA、18s rRNA条带清晰可见,以上结果均提示本研究提取的总RNA浓度和纯度满足实验要求。分别给予0 、0.1 、0.2 、0.4 、0.8 、1.6 和3.2 Gy不同剂量的60Co γ射线照射后,人外周血淋巴细胞中GAPDH、hOGG1、MGMT、PPP2R1A和PPP2R2DmRNA的融解曲线峰形均单一锐利,说明扩增产物反应具有较好的特异性;GAPDH、hOGG1、MGMT、PPP2R1A和PPP2R2D基因mRNA扩增曲线平滑可用,指数期斜率与扩增率成正比,扩增效果较好。各基因扩增后的凝胶电泳图,扩增产物只有一条清晰可见的特异条带,与预测的目的条带位置一致,表明目的片段扩增成功(图1)。
分别给予人外周血淋巴细胞0 、0.1 、0.2 、0.4 、0.8 、1.6 和3.2 Gy不同剂量的60Co γ射线照射12 h后,细胞中hOGG1、MGMT、PPP2R1A、PPP2R2D 基因的转录水平如下表2所示。
hOGG1基因的转录水平在0.1 Gy时达到最高。与对照组相比,hOGG1基因的mRNA转录水平在0.1 Gy和0.2 Gy剂量组均明显升高,差异均有统计学意义(P < 0.05),而在其他剂量组转录水平无明显改变( P > 0.05)。不同剂量组之间两两比较结果见 表2。
MGMT基因的转录水平在0.1 Gy时达到最高。与对照组相比,MGMT基因的mRNA水平在0.1、0.2和0.8 Gy剂量组均明显升高,差异均有统计学意义(P < 0.05),其他剂量组转录水平无明显改变( P > 0.05)。不同剂量组之间两两比较结果见 表2。
PPP2R1A基因的转录水平在0.2 Gy剂量时达到最高。与对照组相比,PPP2R1A基因mRNA水平在0.2 Gy剂量组明显升高,在3.2 Gy剂量组明显降低,差异均具有统计学意义(P < 0.05)。而其他剂量组的转录水平无明显改变( P > 0.05)。不同剂量组之间两两比较结果见 表2。
PPP2R2D基因的转录水平在0.1 Gy剂量时达到最高。与对照组相比,PPP2R2D基因的mRNA水平在0.1、0.2、0.4和0.8 Gy剂量组均明显升高,在3.2 Gy剂量组明显降低,差异均具有统计学意义(P < 0.05)。与对照组相比,1.6 Gy剂量组的转录水平无明显改变( P > 0.05)。不同剂量组之间两两比较结果见 表2。
3 讨论“线性无阈理论”认为任何剂量的辐射对人体都是有害的,但近年研究表明LDR能够诱导机体产生保护性效应,如适应性反应和兴奋性效应[11]。研究表明LDR诱导的适应性反应和兴奋性效应的产生机制与DNA损伤修复酶的修复作用有关,DNA损伤修复酶通过修复细胞DNA损伤,防止细胞癌变,在机体DNA 损伤修复过程中起着重要作用[12]。研究发现在0.01~0.2 Gy范围剂量的LDR易诱导细胞产生适应性反应,而超过0.2 Gy的电离辐射难以诱导出适应性反应[13-14]。本研究也发现随着60Co γ射线照射剂量的增加,hOGG1、MGMT、PPP2R1A和PPP2R2D基因表达总体上呈现先升后降的变化,提示适宜的LDR可诱导hOGG1、MGMT、PPP2R1A和PPP2R2D基因转录水平增高。转录水平达到峰值后,随着照射剂量的逐渐增加,hOGG1、MGMT、PPP2R1A和PPP2R2D基因的转录水平逐渐下降,结果提示超过一定剂量的电离辐射可对机体产生损伤效应,原因可能在于随着照射剂量的增加引起细胞内DNA损伤的程度超过修复酶系统的修复能力,从而使相关修复基因的转录或表达水平下降。
本研究结果发现,在0.1 Gy辐照时可以诱导人外周血淋巴细胞hOGG1的转录水平,提示外周血淋巴细胞在该剂量辐射下具有良好的DNA损伤修复能力。刘芳等研究发现,用不同剂量的60Coγ射线对人肺腺癌上皮细胞A549细胞进行照射,结果表明与正常表达hOGG1的A549细胞相比,缺陷表达hOGG1的A549细胞的氧化损伤增加,细胞存活率下降。研究提示hOGG1基因参与了辐射诱导的细胞DNA损伤的修复,且hOGG1基因的低表达增加肿瘤细胞对射线的敏感性[15]。目前LDR对MGMT基因表达影响存在争议。本研究结果显示在剂量为0.1 Gy时MGMT基因mRNA水平明显增高,随着照射剂量的增加,MGMT基因的转录水平表现为降低趋势。提示较低剂量的电离辐射可能诱导人外周血淋巴细胞MGMT的高转录表达,促进DNA损伤修复,减少辐射对机体的损伤。与本研究结果较一致的是,有研究表明广东阳江高本底辐射地区居民外周血中MGMT表达水平有所升高,提示长期LDR可能对DNA损伤修复能力有增强作用 [16-17]。但李曼蓉研究发现,用剂量率为0.2 Gy/min,5 cGy/d的低剂量X射线照射正常人肝细胞(L-02)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC),两种细胞株均分别照射5 d和10 d,MGMT基因在两种细胞中的表达明显降低,与本次研究结果有所不同[18]。原因可能在于实验条件不同(如采用的射线、照射时间、照射剂量、照射方式等)以及所采用的实验细胞来源不同。
此外,本研究发现在一系列处理组中0.1 Gy和0.2 Gy剂量的照射分别能诱导人外周血淋巴细胞中的PPP2R2D和PPP2R1A基因转录水平达到峰值,提示人外周血淋巴细胞在该剂量辐射下具有良好的DNA损伤修复能力。目前研究表明:DNA损伤后,PP2A通过调控 p53 的磷酸化激活以及G2/M细胞周期检验点的激活阻止细胞进入有丝分裂期,参与了DNA损伤后信号传递、DNA 修复以及细胞凋亡进程等细胞过程[19]。PP2A-A亚基为PP2A二聚体中核心酶,PP2R-Aα(PPP2R1A基因编码)亚基基因编码区的突变在肿瘤发生中起作用[20-21]。有研究表明,受到电离辐射照射后,PP2A还可以对pRB去磷酸化,促进pRB募集到DNA复制起始位点以阻止异常的DNA复制[22]。近年来的研究表明,PP2A-B55δ(PPP2R2D基因编码)的不同亚型在不同细胞或不同条件下可作为与细胞周期依赖性激酶1(CDK1)反作用的磷酸酶发挥功能,但也有研究结果表明,包含B55δ调节亚基的PP2A合酶能拮抗CDK1的作用[23]。本研究结果提示,LDR可能通过诱导PPP2R1A基因和PPP2R2D基因的高表达,阻止细胞突变,从而降低辐射损伤效应的风险。
综上所述,0.1 ~0.2 Gy的LDR可以诱导人外周血淋巴细胞产生辐射兴奋效应,通过诱导DNA损伤修复酶基因hOGG1、MGMT、PPP2R1A和PPP2R2D转录水平的增高,从而增强DNA修复能力,降低辐射损伤效应,但是当辐射剂量超过0.2 Gy(即超过低剂量水平)时,DNA损伤修复酶相关基因转录水平有所下降,提示机体内各损伤修复酶的修复能力随着辐射剂量的增加而有所降低。本研究后续将在低剂量(0~0.2 Gy)内进行剂量—效应或时间—效应关系研究,为低剂量电离辐射兴奋性效应或适应性反应机制研究提供一定的科学理论依据。
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