烟草作为一种重要的经济作物，在我国种植面积已经超过了2 000万亩，其中中南部地区的气候最适宜种植。然而，在烟草废弃物中有大量未被利用的部分，包括了茎杆、枝杈、低次烟叶等，其大部分被就地焚烧，造成大气污染，有的堆放于田间、沟渠、河流旁，在南方湿润的气候下，湿润和腐烂会导致水体环境富营养化，造成生物养分的流失和不被循环利用，资源的浪费^[1]。绿原酸是烟草中的香味成分，利用废弃的烟叶提取绿原酸，可实现烟草废弃物的资源化利用^[2]。绿原酸具有广泛的药理活性和药用价值，有抗菌解毒、消炎利胆、抗癌、降糖降脂等功效^[3]。完善烟草废弃物的绿原酸提取的工艺，对绿原酸药用开发有重要意义。

目前常用的绿原酸提取方法已经发展出了回流提取法、酶处理法、超声波提取法、超临界流体萃取法以及微波联合超声波辅助提取法，不同特性植物的提取方法存在较大差异^[4]。本文就乙醇回流提取法对低次烟叶绿原酸的提取模型展开实验研究。在最佳提取工艺为乙醇浓度67%、料液比(g:mL)1:16、温度61℃、提取时间为150 min的前提^[5]下, 根据天然药物提取过程中的动力学数学模型^[6-7]，提出了废弃烤烟绿原酸提取的动力学仿真模型，采用高效液相色谱测定烟叶绿原酸含量的方法，确定模型参数。并且验证了模型仿真结果的准确性，给出了绿原酸提取过程中含量的大致变化规律，为绿原酸提取工艺研究提供进一步参考依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂

绿原酸标准品购于美国Sigma公司(纯度>98%)；低次烟叶购于中国烟草中南农业试验站；乙腈和甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.1.2 主要仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪、ZORBAX SB-C18色谱柱、一次性针筒过滤器；紫外可见分光光度仪(天津冠泽科技有限公司)；数字控温电热套(天津泰斯特仪器公司)；循环水式真空泵(巩义予华仪器有限公司)；台式低速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)；旋转蒸发仪(巩义予华仪器有限公司)。

1.2 方法 1.2.1 回流提取液的制备

低次烟叶购于中国烟草中南农业试验站，粉碎至0.25 mm，过筛。精密称取5g低次烟叶粉末状样品于圆底烧瓶中，按照物料重量(kg)：液体(mL)1:10，加入60%的乙醇溶液，在水浴温度和瓶内溶液温度同为60℃的条件下，加热回流2 h。之后立即过滤，收集的滤液为绿原酸提取液。

实验在物料重量(kg) :液体(mL)恒定为1:10，乙醇浓度为60%且为同一批溶液的条件下，分别在50℃、60℃、70℃三个温度梯度下，测定对应时间(60、80、120、140、160、180、40、60、80、120、150、180、40、60、80、130、170、190 min)的提取浓度用于仿真模型验证。

1.2.2 反相高效液相色谱法 1.2.2.1 检测条件

色谱柱(ZORBAX SB-C18，4.6 X250 mm，5 μm)，流动相A：0.5%乙酸水溶液；流动相B:乙腈；流速：1 mL/min；柱温35℃；进样体积20 μL; 检测波长327 nm，检测时间20 min；梯度洗脱分为三个阶段：0~10min，A：90%，B:10%; 10~15 min，A：59%，B:41%；15~20 min，A：90%，B:10%。

1.2.2.2 检测方法

采用外标法，取绿原酸标准品20 mg，分别在超声条件下溶于95%甲醇，定容制成0.4 mg/mL的绿原酸标准液。取原液0.5、1.5、2.5、3.5、5 mL样液用容量瓶定容至10 mL超声条件下排汽泡之后，经过0.45 μm滤膜的注射器，装入进样瓶待测。用甲醇超声溶解后，定容配置成不同的浓度梯度，分别取一定体积的标准液进样，测出色谱图峰面积。取5、9、13 min的不同异构体峰面积进行求和，以总峰面积为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘制出标准曲线。吸取不同提取时间条件的提取液，取1 mL用容量瓶定容至10 mL，于超声条件下排汽泡，之后经过0.45 μm滤膜的注射器，装入进样瓶待测。从色谱图上测出绿原酸的峰面积，通过标准曲线换算出相应绿原酸含量。

1.2.3 最大提取率C_max和二阶提取速率常数k的求解

由化学动力学模型模拟低次烟叶中绿原酸提取的动力学过程。应用数学模型公式如(1)所示：

$ \frac{{{\rm{d}}{C_{\rm{t}}}}}{{{\rm{d}}t}} = k{\left( {{C_{{\rm{max}}}} - {C_{\rm{t}}}} \right)^2} $

(1)

t为提取时间，温度稳定后开始计时；C_t:在t时刻提取液绿原酸浓度，g·mL^-1；C_max：提取液绿原酸的最大浓度，即饱和时绿原酸的质量浓度，g·mL^-1；k为提取速率常数g·mL^-1·min^-1。

对式(1)进一步整理可以转化为式(2)所示：

$ \frac{t}{{{C_{\rm{t}}}}} = \frac{1}{{k{C_{\max }}^2}} + \frac{t}{{{C_{\max }}}} $

(2)

根据表达式(2)，t/C_t对t作图得出的曲线，对数据进行的线性拟合，得y=at+b回归方程，通过t/C_t对t作图求出a，根据$a = \frac{1}{{{C_{\max }}}}$可求出最大提取率C_max。根据$b = \frac{1}{{k{C_{\max }}^2}}$，在求出C_max后，求出二阶提取速率常数k。

1.2.4 提取活化能E_a的求解

根据Arrhenius方程^[8]有公式(3)的表示：

$ k = {k_0}{{\rm{e}}^{ - {E_a}/(RT)}} $

(3)

提取速率常数k和温度T之间的关系可以由(3)转化为(4)表示如下：

$ \ln k = \ln {k_0} - {E_a}/(RT) $

(4)

k为提取速率常数g·mL^-1·min^-1；k₀为与温度无关的常数，g·mL^-1·min^-1；E_a为提取活化能，J/mol；R为气体常数，8.314 J/(mol·K)；T为提取时的绝对温度，K。

再通过lnk对1/T作图得出的曲线，对数据进行的线性拟合，得y=at+b回归方程, 根据根据a=-E_a/R得出活化能E_a。

其中活化能的微分表达式可由(4)推导为(5)所表示：

$ {E_a} = - R\frac{{d\ln k}}{{d(1/T)}} $

(5)

由此可以确立在烤烟叶提取特性下的活化能。

1.2.5 matlab仿真曲线的建立

把(3)代入(1)得C_t与温度T及时间t的关系公式(6)表示如下：

$ \frac{{{\rm{d}}{C_{\rm{t}}}}}{{{\rm{d}}t}} = {k_0}{{\rm{e}}^{ - {E_\alpha }/(RT)}}{\left( {{C_{\max }} - {C_{\rm{t}}}} \right)^2} $

(6)

运行matlab平台的simulink程序，建立公式(6)的仿真框图模型如图 2所示，该框图模型需要通过实验的方法确定模型参数，从而运行仿真框图模型获得预测提取数据的曲线。

当设定提取温度T=[333.15K], 且预测对应提取最大浓度C_max=[0.000 528 g·mL^-1]，k₀=172.03g·mL^-1·min^-1, E_a=5494.972 J/mol时，在60℃条件下，仿真从开始提取到计时到500 min的绿原酸浓度，可得预测matlab仿真曲线如图 3所示。

2 结果 2.1 HPLC标准曲线的建立

如表 1所示，取四组绿原酸标准品，测定各组样品在不同浓度下的总峰面积。其中四组平行样品的峰面积RSD在8%~14%之间，说明标准品的回收率在87%~114%之间。以四组样品峰面积平均值为纵坐标，绿原酸标准品含量为横坐标，建立标准曲线如图 4所示。线性回归方程为：y=23.066x+291.06，相关系数R²=0.9917。

2.2 绿原酸提取实测数据与分析

实验分别在50℃、60℃、70℃三个温度梯度下，测定对应时间下的提取浓度用于仿真模型验证，实验测得绿原酸浓度C_t对时间t的数据结果如表 2所示。

建立50℃、60℃、70℃条件下，绿原酸的提取浓度随时间变化曲线，如图 5所示。

由图可以看出，在50℃、60℃的情况下，绿原酸的提取含量随着时间而升高。同时可看出，处理约150 min后，绿原酸的提取已经接近饱和。在70℃的情况下，绿原酸的提取含量在0~150 min处于升高到接近饱和，150 min后降低。这可能是因为绿原酸结构并不稳定，高温长时间提取容易导致分解。在热温提取过程中，由于绿原酸属于多酚，而多酚可能会与蛋白质、多糖、果胶形成沉淀物^[9]，因此，这里导致了绿原酸提取数据稍微低于理想值。

为了确定最大提取率C_max、二阶提取速率常数k以及提取活化能E_a。通过t/C_t对t作图得出如图 6所示的曲线，其中50℃、60℃、70℃的相关系数分别为0.994、0.985、0.982。对数据进行的线性拟合，得y=at+b回归方程, a=[1 650.3、1 062.6、881.99]，b=[49 292、21 390、7 964.2];对照公式(2)有$y = \frac{t}{{{C_t}}},a = \frac{1}{{{C_{\max }}}},b = \frac{1}{{k{C_{\max }}^2}}$,得温度50℃、60℃、70℃下的最大提取率C_max =[0.000 606 g·mL^-1、0.000 941 g·mL^-1、0.000 113 4g·mL^-1]和提取速率常数k=[55.25、52.78、97.67]。

通过lnk对1/T作图得如图 7所示的曲线。T是开尔文温度。50℃、60℃、70℃分别对应323.15K、333.15K、343.15K。对数据进行的线性拟合，得k₀ =775 295.86 g·mL^-1·min^-1和E_a=25 950.48 J/mol。

2.3 绿原酸提取仿真数据与分析

为了得到预测提取数据曲线，可将实测所求的Arrhenius方程k₀=775 295.86 g·mL^-1·min^-1，活化能E_a=25 950.48 J/mol，以及预测提取温度T=[323.15K、333.15K、343.15K], 及对应温度提取最大浓度C_max=[0.000 606 g·mL^-1、0.000 941 g·mL^-1、0.000 113 4g·mL^-1]等数据输入到图 2所示的低次烟叶中绿原酸提取matlab仿真模型中，启动仿真后得到预测提取数据曲线如图 8所示。

为了验证模型仿真的有效性，同时将实测数据绘入图 8与所仿真数据进行对比，从图中可以看出两者符合度较好。由图 4、8可知，绿原酸随时间的溶出行为可以用动力学模型曲线进行拟合。随着提取温度的增加，绿原酸的提取浓度随之提高；由图 8还可知，随着提取时间的增加，绿原酸提取浓度会达到相对饱和，增加缓慢。

3 讨论 3.1 模型活化能用于预测提取数值

提取活化能是指在溶液升温过程中，非活化分子转变成活化分子所需的能量。在烟叶提取绿原酸动力学模型中，活化能是指绿原酸从原料中扩散到溶剂中所需的最小能量。活化能的大小与提取原料特性有关。

由活化能的微分表达式可知道，在不同温度下，活化能特性能影响提取反应速率。根据在低次烟叶提取模型，测定提取反应活化能，有助于我们进一步研究，低次烟叶和其他药用植物在活化能方面存在的差异。在同样实验处理条件下，根据各自的提取活化能，设定提取工艺时间，提高提取效率。

3.2 小结

本研究先建立了废弃烤烟绿原酸提取的动力学模型；并建立该模型在matlab仿真平台下的simulink仿真程序模型；通过实验的方法确定其参数，如低次烟叶中绿原酸提取过程的活化能为25 950.48 J/mol；运行该仿真程序模型可随时得到相近温度下的提取预测数据曲线，用于指导设计工艺实验。

通过验证预测模型仿真结果的准确性，说明该模型较好地模拟和预测了绿原酸的提取过程，可进一步确立从低次烟叶中提取绿原酸的较优工艺，为利用低次烟叶中功能性物质提供了新的参考。