2. 吉林大学第二医院放射线科;
3. 吉林大学第二医院放疗科
2. Department of Radiology, Second Hospital of Jilin University;
3. Department of Radiotherapy, Second Hospital of Jilin University
ATRX(alpha thalassemia/mental retardation syndrome X-inked protein)蛋白是SWI2/SNF2蛋白家族的成员，具有广泛的生物学作用，能够影响染色质重组以及在修复DNA损伤、调节转录等过程中发挥作用，而且对调节肿瘤细胞端粒不正常延长(Alternative Lengthening of Telomeres，ALT)有重要影响[1-3]。H2AX可以作为DNA双链断裂的标志，用荧光标记其磷酸化表达后，计数荧光焦点的个数，从而得出辐射剂量与DSB数量的关系[4-5]。人类RAD51蛋白在同源重组修复中，是催化断裂的DNA双链与完整的同源DNA姐妹链进行链间转移置换的关键酶，RAD51蛋白表达的失调可促进肿瘤的发生和发展。本研究通过RNAi靶向沉默H460细胞中ATRX，进而检测细胞增殖、γH2AX和RAD51的焦点形成，以及PARP1、γH2AX和RAD51蛋白的表达，判断沉默ATRX后辐射对增殖及DNA辐射损伤修复的影响，明确二者的相互关系，进一步为基因放射治疗肿瘤提供新的支撑和实验证据。
1 材料与方法 1.1 主要实验试剂和仪器人肺癌H460细胞和293T细胞由本实验室保存，MEM培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)，质粒转染采用转染试剂Hieff-TransTM(上海翊圣生物科技有限公司)，青链霉素(Thermo Fisher scientific公司，美国)，兔多克隆一抗包括ATRX、磷酸化H2AX(γH2AX)、Rad51、poly ADP-ribose polymerase 1(PARP1)和GAPDH(Santa Cruz公司，美国)，红色荧光标记的抗兔二抗(CST公司，美国)，HRP标记的抗兔二抗(Immunoway公司，美国)，嘌呤霉素(Sigma公司，美国)，X-RAD 320i X射线辐照仪(Precision X-ray公司，美国)，SDS-PAGE系统(BioRad公司，美国)。
1.2 靶向沉默ATRX的H460细胞的获得靶向ATRX的3段shRNA的序列分别为ATCCTCAAGAGGTTGAATC、TTTCTTATGTTCACCACCG和TTATCTTGTGGAACTTCCT。分别构建到pGIPz载体上，设立shControl对照，采用293T细胞进行病毒包装，按照质量shRNA :pSPAX2 :pMD2G=2 :1 :1进行质粒转染，所用试剂为Hieff TransTM转染试剂，48 h后收取1次病毒，72 h后收取2次病毒，0.45 μm滤膜过滤后感染H460细胞，利用嘌呤霉素进行阳性筛选，所得细胞模型命名为shControl-H460、shATRX1-H460、shATRX2--H460和shATRX3-H460，并提取总蛋白后Western blot进行沉默效率验证，同时逐渐将细胞扩大并冻存液氮中备用。
1.3 克隆形成实验分别将shcontrol-H460、shATRX2-H460和shATRX3-H460细胞接种于6孔板中，接种密度为每孔80、200、800、4 000和20 000个细胞，12 h后进行0、2、4、6和8 Gy照射，并继续培养10 d，利用带有甲醛的吉姆萨染液染色后进行克隆计数，按照存活分数(survival fraction，SF)=受到一定剂量照射的克隆数/(接种的单个细胞数×PE)，PE为未照射时形成的集落数与接种的单个细胞数，绘制SF与照射剂量的关系图，评价细胞增殖能力。
1.4 免疫荧光检测γH2AX和Rad51焦点形成分别将shControl-H460和shATRX3-H460细胞接种于放置了盖玻片的6孔板中，按照1 × 105个/孔，12 h后进行4 Gy X射线照射，于0、0.5、1、3和6 h固定(4%多聚甲醛)，2% BSA + 0.3% TritonX100封闭1 h，γH2AX和Rad51一抗(1:500)4℃过夜孵育，PBS洗5次，每次5 min，红色荧光二抗(1 :1 000)室温孵育1 h，PBS洗5次，每次5 min，8 μl的DAPI滴加到载玻片上，封片后荧光显微镜下观察γH2AX和Rad51焦点形成，并随机选取5个视野，每个视野选择5个细胞，计数焦点数。
1.5 Western blot按照实验分组，shcontrol-H460和shATRX3-H460细胞接种于6孔板，80%~90%融合后进行4 Gy X射线照射，0、0.5、1、3和6 h收样并提取总蛋白，100 ℃变性蛋白，SDS-PAGE电泳，4℃过夜转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后，ATRX、PARP1、γH2AX、Rad51和GAPDH(1:1 000)一抗，37℃孵育2 h后TBST洗3次，每次10 min，加入HRP标记的二抗(1:3 000)后37℃孵育1 h，TBST洗3次，利用ECL发光液在暗室中反应并曝光，拍照分析。
1.6 统计学处理γH2AX和Rad51焦点数以x±s表示，利用SPSS 24.0统计软件t检验进行分析，P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 ATRX沉默效率判定由图 1可见，泳道1和泳道2中ATRX表达正常，而在泳道3~5可见ATRX蛋白低表达，说明沉默ATRX的细胞模型建立成功。
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图 1 Western blot检测各种细胞模型中ATRX蛋白的表达 注：泳道1：H460；泳道2：shControl-H460；泳道3：shATRX1-H460；泳道4：shATRX2-H460；泳道5：shATRX3-H460 |
由图 2可见，0、2、4、6和8 Gy照射后shATRX2-H460和shATRX3-H460细胞的存活分数均较shControl-H460细胞的存活分数低，提示其增殖能力的降低，且shATRX2-H460和shATRX3-H460之间无明显差异。
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图 2 不同剂量照射后细胞存活分数的变化 |
由图 3可见，荧光显微镜下4 Gy照射后shControl-H460和shATRX3-H460组细胞中γH2AX和Rad51焦点形成，分别计数0~6 h γH2AX和Rad51焦点数，shControl-H460和shATRX3-H460组细胞中γH2AX在1 h时最多，而Rad51焦点数在3 h时最多，且均显著高于0 h时(P < 0.001)，而后逐渐降低，与shControl-H460细胞比较，在1和6 h时shATRX3-H460细胞γH2AX焦点，以及1、3和6 h时Rad51焦点显著增多(P < 0.05，P < 0.01)，见表 1。
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图 3 荧光显微镜观察4 Gy照射后0 ~ 6 h的γH2AX和Rad51焦点形成 |
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表 1 4 Gy照射后0 ~ 6 h的γH2AX和Rad51焦点数的变化(n=25，x±s) |
由图 4可见，4 Gy照射后3和6 h，shATRX3-H460细胞中PARP1、Rad51和γH2AX蛋白表达均高于shControl-H460细胞，提示DNA损伤后修复的较慢。
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图 4 Western blot法检测4 Gy X射线照射后PARP1、γH2AX和Rad51蛋白表达 |
肿瘤基因—放射治疗研究是辐射肿瘤学相关研究的热门，如何提高肿瘤细胞放射敏感性成为相关学科研究的热点。DNA是辐射的敏感靶点，损伤后可导致DNA单链断裂(Single strand breaks，SSB)、双链断裂(double strand breaks，DSBs)、碱基的修饰和丧失碱基位点等，其中DSB最严重[6-8]。而且，主要通过同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(Non-Homologous end joining，NHEJ)完成损伤修复。遵循DNA损伤，修复不能成功，影响细胞生存的基本思路，将DNA损伤及其修复作为肿瘤基因放射治疗的靶点[9]。DNA损伤修复涉及到非常多的基因，ATRX基因具有维持DNA结构和直接连接到双链断裂位点等功能，是重要的DNA损伤修复基因[10-11]。本研究中利用靶向ATRX基因的慢病毒感染H460细胞获得靶向沉默ATRX的稳定细胞模型，Western blot结果显示，3条靶向序列具有较好的沉默效果，可作为候选细胞进行后续研究。
电离辐射的重要的靶点包括细胞膜、细胞核和细胞器等，电离辐射时，DNA的DSB与染色体结构和辐射相关因素有关[12]。而且，肿瘤的放射治疗中，射线损伤DNA，继而导致修复障碍，从而导致细胞死亡而抑制细胞的增殖[13]。HR和NHEJ损伤修复时，涉及到多种信号通路，Rad51蛋白是HR的关键酶，是损伤的感应器和周期检查点关键蛋白，此外，还需要交叉互补修复基因2(X- ray repair cross-complementing gene 2，XRCC2)蛋白共同完成[14]。而电离辐射引起的DSBs均伴随γH2AX的簇集，且γH2AX核灶形成没有细胞特异性。Rad51和γH2AX的焦点形成均可以作为判断DNA损伤修复程度的指标。
本研究中发现，shControl-H460、shATRX2-H460和shATRX3-H460细胞在照射后存活分数存在差异，后2者的SF在相同剂量照射后明显降低，暗示着增殖被抑制，可能具有较高的放射敏感性。继而将shControl-H460和shATRX3-H460细胞作为研究对象，4 Gy照射后0~6 h内，γH2AX和Rad51焦点的形成在2种细胞间存在明显的差异，分别在1和3 h时达到最大值，并逐渐消退。γH2AX和Rad51焦点数是研究辐射损伤DNA导致DNA链断裂的重要指标，而且PARP1也是重要的调控DNA损伤修复的因子[13]，本研究也证实辐射后ATRX缺失的H460细胞中PARP1、γH2AX和Rad51蛋白表达也具有明显的差异，提示细胞激活DNA损伤修复后，修复比对照组缓慢，这也是其导致细胞增殖变慢的原因之一。
综上所述，本研究所进行的ATRX靶向RNAi，可以实现ATRX蛋白低或无表达，并且能够抑制H460细胞增殖，可能与辐射所致的DNA损伤修复能力降低，进而导致细胞死亡有关，为临床肿瘤的放疗提供一个新的参考和实验数据。
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