2. 中国空军军医大学预防医学系辐射防护医学教研室
2. Department of Radiation Protective Medicine, Faculty of Military Preventive Medicine, Air Force Medical University
辐射对造血系统的损伤主要表现为造血干细胞自我更新能力的下降甚至完全丧失，即骨髓抑制[1]。而利用我国博大的中医宝库和丰富的自然资源研究中草药作为辐射防护剂，为防治辐射所致各种损伤提供了新思路[2]。文献显示具有一定生物活性的中草药可以改善造血系统损伤的程度，从而改善因血细胞数量下降引起的出血、感染等症状[3]。五倍子酸(简称GA)，是一种天然的多酚类化合物，为中药五倍子的主要有效成分，研究发现其具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗突变等作用[4-5]。且已证明具有抗氧化活性的中草药有辐射防护作用，因此将GA作为辐射防护剂研究意义重大[3]。本文通过观察辐照后小鼠脾重、脾系数、脾结节数、外周血细胞、脾脏中有关凋亡蛋白Bax、Bcl-2、P53凋亡含量和凋亡相关激酶Caspase3的变化，探讨GA对辐照小鼠的防护效应及其机制。
1 材料与方法 1.1 材料雄性ICR(Institute of Cancer Research)小鼠，6周龄，体重(25±2)g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。雄性BALB/c小鼠, 4~6周龄，体重(20±2)g，购于空军军医大学动物中心。氨磷汀(WR-2721)(购自大连美罗大药厂)。五倍子酸(GA, 白色粉末，纯度＞98%)，购于空军军医大学药剂教研室。GA结构如图 1所示。
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图 1 五倍子酸分子结构 |
将小鼠领回后给予充足的空间、食物和水，室温22 ℃~24 ℃，正常饲养4 d，按体重随机分组。ICR小鼠和BALB/c小鼠分别分为5组，即对照组、60Co-γ射线辐照组、GA(100 mg/kg)+γ射线辐照组、GA(200 mg/kg) +γ射线辐照组、WR-2721(200 mg/kg)+γ射线辐照组，每组10只。
1.3 处理及暴露方法① ICR小鼠对照组和辐照组：分别给予RO水0.3 ml/只，每天一次，照前3 d开始灌胃直至照后9 d，共12 d。药物+辐照组：分别用100 mg/kg和200 mg/kg的GA 0.3 ml/只灌胃，每天一次，照前3 d开始灌胃直至照后9 d，共12 d。阳性对照组：照前30 min给予一次性腹腔注射200 mg/kg的WR-2721 0.3 ml/只。②BALB/c小鼠对照组和辐照组：分别给予RO水0.3 ml/只，每天一次，照前3 d开始灌胃直至照后7 d，共10 d。药物+辐照组：分别用100 mg/kg和200 mg/kg的GA 0.3 ml/只灌胃，每天一次，照前3 d开始灌胃直至照后7 d，共10 d。阳性对照组：照前30 min给予一次性腹腔注射200 mg/kg的WR-2721 0.3 ml/只。
ICR小鼠和BALB/c小鼠经不同处理分别暴露于8 Gy、4 Gy 60Co-γ射线, 给予全身一次性照射。照后正常饲养至一定时间节点终止实验。各组给药剂量和照射条件均采用预实验结果。
1.4 五倍子酸对辐射小鼠脾重、脾系数和脾结节形成力的影响ICR小鼠按以上分组，每组10只，分别给予不同处理和8 Gy照射，照后9 d终止实验，各组动物对应称重后脱臼处死，取脾脏称重、计算脏器指数(脏器指数=脏器重量/体重×103)。每组10只脾脏盐水冲洗后即刻固定于Bouin′s固定液中，24 h后肉眼计数脾结节形成个数，脾结节过多肉眼不好计数时记30个, 测定骨髓干细胞增生能力[6]。
1.5 五倍子酸对辐射损伤小鼠体重和外周血象的影响BALB/c小鼠按以上分组，每组10只，分别给予不同处理和4 Gy照射，分别于照前1 d、照后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d在称重后采取眼内眦取血法取血200 μL/只，用全自动血细胞计数仪进行外周血中白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、淋巴细胞(LYM)、血小板(PLT)数目测定[7]。
1.6 五倍子酸对辐射损伤小鼠脾脏凋亡相关蛋白和激酶的影响BALB/c小鼠按以上分组，每组10只，分别给予不同处理和4 Gy照射，照后7 d脱臼处死。①蛋白样品制备：每组取脾脏6只，匀浆后提取组织蛋白，冰上裂解15 min，在4 ℃条件下，12 000 rpm离心10 min。用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。②蛋白免疫印迹：取组织蛋白30 μg，加入缓冲液，沸水浴5 min，然后进行SDS-PAGE分离蛋白。采用湿转法将蛋白质转移至PVDF膜上。转膜结束后，将PVDF膜放在丽春红染色液中染色2~5 min，观察蛋白转移效果。将PVDF膜转移至含有5 % BSA的TBST封闭液中，室温封闭1.5 h。加入一抗4 ℃过夜，次日，将PVDF膜放入含二抗中，孵育1 h。在增强化学发光反应混合液中反应2~3 min后，压片显影[8]。样本中蛋白表达量用Quantity One-4.6.2 (Bio-Rad, Hercule, CA)软件进行半定量分析处理[9]。
1.7 统计学分析采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析，所有实验数据以x±s表示，总体均值之间的统计学差异采用方差分析；各处理组与对照组均值比较，采用配对t检验法，实验至少重复3次，以P＜0.05差异有统计学意义。
2 结果 2.1 五倍子酸对辐射小鼠脾重、脾系数、脾结节形成力的影响表 1显示8 Gy的60Co-γ射线照后第9 d小鼠的体重、脾重、脾系数和脾结节形成力的变化。与空白对照组组相比：辐照后各组体重均有下降趋势，但无统计学差异(P＞0.05)；与8 Gy辐照组相比，各处理组体重有上升趋势，但无统计学差异(P＞0.05)。100 mg/kg和200 mg/kg的GA均能显著改善辐照引起的小鼠脾重下降的程度(P＜0.05)，200 mg/kg的GA和阳性对照组均能显著改善脾系数下降的程度，并能明显提高受照小鼠脾结节形成能力(P＜0.05)。本实验发现，GA预处理能减轻辐照引起的体重和脾重下降、增加脾系数和脾结节形成个数，提示GA可保护辐照后的造血干细胞。
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表 1 五倍子酸对受照小鼠脾系数及脾结节形成力的变化(x±s) |
图 2显示五倍子酸对受照小鼠体重的影响。从观察小鼠进食情况和体重测量结果可知照前各组小鼠体重并无明显差异，辐照后各组小鼠体重均有不同程度的下降。与4 Gy辐照组相比，100 mg/kg、200 mg/kg的GA预处理组和阳性对照组均能在照后3 d体重开始上升至照后21 d恢复正常，而辐照组照后21 d体重虽有一定程度上升，但仍明显低于其它各组。
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图 2 五倍子酸对受照小鼠体重的影响 注：1)表示与射线辐照组比，P＜0.05。 |
图 3是4 Gy60Co-γ射线照射后28 d内小鼠外周血中RBC、WBC数量和LYM及PLT含量的变化。如图 3A所示，辐照后小鼠外周血中RBC数量均有不同程度下降。与辐照组相比，GA预处理组小鼠至照后第7 d RBC数目开始回升。辐照组小鼠RBC数至照后14 d下降至最低值，与GA预处理组和阳性对照组对比差异显著(P＜0.05)。图 3B所示，辐照可致小鼠外周血中WBC数量显著下降，在照后第7 d达到最低值。GA预处理组照后21 d开始显著回升至照后28 d恢复正常。辐照组小鼠与GA预处理组和阳性对照组相比并未使WBC数显著上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。图 3C所示，辐照后LYM水平显著下降，照后第7d达到最低值。GA预处理组和阳性对照组小鼠照后21d起淋巴细胞回升显著，与辐照组相比差异显著(P＜0.05)。图 3D所示，辐照后PLT含量在第7 d下降至最低值，GA预处理组和阳性对照组照后第14 d上升显著与辐照组相比差异显著(P＜0.05)。可见，一定浓度的GA预处理能降低RBC和WBC数量下降的程度，并能显著改善因辐照引起的LYM和PLT含量减少(P＜0.05)。
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图 3 五倍子酸对受照小鼠外周血象的影响 注：1)表示与射线辐照组比，P＜0.05。 |
本实验检测了辐照后7 d小鼠脾脏中凋亡相关蛋白Bax，Bcl-2，p53蛋白含量和凋亡相关激酶Caspase3的变化，结果如图 4A、4B、4C、4D、4E显示，辐照虽然一定程度上可引起脾脏细胞Bax、Bcl-2水平下降，但与辐照组相比200 mg/kg的GA和阳性对照组均能显著提高Bcl-2水平，差异有统计学意义(P＜0.05)。GA预处理组和阳性对照组Bax/Bcl-2的比值显著下降，而辐照组显著上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。如图 4D、4E所示GA预处理组与辐照组相比均并没有引起凋亡相关蛋白p53和凋亡相关激酶Caspase3的变化，差异无统计学意义(图 3A)。说明GA一定程度上能够促进抗凋亡蛋白的表达，但对P53和Caspase3的表达无显著影响。
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图 4 五倍子酸对受照小鼠凋亡相关蛋白和激酶的影响 注：1)表示与辐照组相比P＜0.05。 |
脾脏是参与机体造血及免疫调节的重要器官，也是辐射高度敏感的器官之一。辐照后可观察到脾脏体积缩小和重量减轻等变化。啮齿类动物中脾结节数目可以间接性的反应残存的具有自我分化和更新能力的造血干细胞的数目，也反应了照射后体内存活造血干细胞的数量。而本实验条件下，8 Gy照射后GA对受照小鼠脾系数及脾结节形成力有显著防护作用。同时，造血系统具有不断增殖和快速更新的特点是电离辐射高度敏感组织。辐射使造血系统增殖能力破坏、导致骨髓移植和脾脏造血干细胞损伤及造血微环境破坏等。因此受照后外周血中RBC、WBC数量和LYM、PLT的含量的变化能够客观地反映造血系统损伤的程度。本实验条件下，4 Gy照射后，GA能有效减轻外周血中RBC和WBC数量下降的程度，并能显著改善因辐照引起的LYM和PLT含量减少。此外，本研究发现GA可使脾脏凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的比值显著下降，但对P53和Caspase3则无明显改变。说明GA能对辐射引起小鼠损伤有一定防护作用，其机制可能与保护造血系统、减轻辐射引起细胞凋亡有关。
电离辐射已广泛存在于生产、生活的各个方面，已有研究表明过度使用低剂量电离辐射对心血管疾病的发生具有一定相关性[10]。此外，电离辐射还会产生急性、慢性放射病等各种损伤，如何趋利避害而更好的利用辐射已成为辐射防护研究的热点。文献显示，GA能选择性抑制肿瘤细胞的生长，而对正常细胞无杀伤作用，这一特点决定了其作为辐射防护剂研究的可行性[11-12]。本研究已经初步证明GA对辐射损伤具有一定的防护作用，且已证明其机制可能与保护造血系统、减轻细胞凋亡有关，为五倍子酸防护作用机制的研究和其进一步应用提供了一定理论依据。然而，GA是否对生殖、消化和神经系统也具有辐射防护作用，以及其辐射防护的机制是否与清除自由基、减轻DNA损伤等有关尚未被阐述清楚，需要通过实验做进一步探讨。
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