肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率高。丰富而又扭曲的血管是肝癌的重要特性，新生肿瘤血管的形成可分为：肿瘤血管生成的启动、血管内皮细胞增殖及向肿瘤实体组织迁移、新生毛细血管成熟三个主要步骤^[1]，抑制上述过程将能阻止肿瘤组织的发展及转移^[2]。Polo样激酶1(Polo-like kinase1, Plk1)是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族一员^[3]。体外和体内实验表明对比单独照射或单独抗Plk1药物治疗，药物抑制Plk1表达能显著增强局部肿瘤控制能力^[4]。STAT3是转录因子在许多肿瘤类型中调控肿瘤进展和恶性相关的细胞周期、细胞生存和免疫应答。STAT3活化后形成二聚体转位到细胞核，结合DNA促进靶基因转录与抗凋亡、血管生成和侵袭/迁移^[5]。本研究以人肝癌血管内皮细胞(TEC)为研究对象，研究一定剂量X射线照射对TEC细胞迁移的影响并探讨其可能的机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株

TEC为本室液氮保存。

1.1.2 试剂与仪器

胎牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司；RPMI-1640培养基购自美国HyClone公司；BI2536激酶抑制剂由军事医学科学院胥全彬博士惠赠。蛋白酶抑制剂购自Roche公司；抗Plk1抗体购自Santa cruz公司；抗STAT3、p-STAT3Y705抗体购自Cell signal公司；抗β-actin抗体购自Sigma公司；羊抗鼠二抗和脱脂奶粉购自Amersham Pharmacia Biotech公司；蛋白质预染marker购自Invitrogen公司；ECL显色系统购自Perkin Elmer公司；ChemiDoc MP凝胶成像系统购自BIO-RAD公司。

1.2 方法

细胞培养：细胞株用含有20%灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液培养，孵箱温度37℃并含5% CO₂。加入0.01 μM/ml BI2536抑制Plk1激酶活性后8~9 h收集细胞。

实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测目标基因表达：使用QIAGEN总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。Plk1的引物序列如下：Plk1上游5’-AGTTATTCATCGAGACCTCAA-3’，下游5’-CACCTCGGGAGCTATGTAAT-3’，Plk1-TaqMan ATTTTGGACTGGCAACCAAA，PCR产物长度为154bp。β-Actin内参引物序列如下：上游5’-TGCCGACAGGATGCAGAAG-3’，下游5’- GCCGATCCACACGGAGTACT-3’，β-Actin-TaqMan AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCG，PCR产物长度为100 bp。20 ul的PCR反应体系：去离子水6.0 ul；Mix 10.0 μl；上下游引物各1.0 μl；TaqMan探针1 μl；模板1 μl。将加好的样品放人Roehe LightCyeler480荧光定量PCR仪中，按如下反应条件扩增：95℃，3 min；95℃，10 sec；60℃，30 sec；共45个循环。ΔΔct法计算各组Plk1 mRNA相对对照组表达水平。

X射线照射TEC细胞：取处于对数生长期的TEC细胞，加含10%FBS的RPMI 1640培养基，室温下以Precise直线加速器(瑞典Elekta公司)产生的X射线进行单次照射，源皮距为100 cm，X射线能量为6 MV，剂量率为442.89 cGy/min，吸收剂量为2 Gy；照射后继续培养24 h。

细胞划痕实验检测细胞迁移能力：常规消化指数生长期的TEC细胞，计数，以1×10⁵个/皿的浓度将细胞接种于60 mm小皿中，37℃、5%CO₂和95%湿度环境下培养过夜。用无菌的10 μl移液器枪头垂直在细胞生长面垂直划痕。用PBS洗涤细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，倒置显微镜下拍照。放入37℃、5%CO₂和95%湿度环境下继续培养，24 h在倒置显微镜下拍照。

蛋白提取及免疫印记分析：照射24 h后收集细胞，用3 ml预冷的1×PBS洗涤细胞，4℃、4 000 r/min离心3 min，弃上清，反复2次；将细胞与裂解缓冲液(50 mM Tris-Cl，pH8.0、0.5 mM EDTA、150 mM NaCl、1% NP-40、蛋白酶抑制剂1片/50 ml)混匀，冰浴裂解20 min，4℃、14 000 r/min离心10 min，吸取细胞裂解上清加入SDS上样缓冲液，沸水浴5 min，离心，进行SDS-PAGE，电泳结束后转移至PVDF膜(Milipore公司)，用封闭液(5%脱脂奶粉)室温封闭1 h或4℃过夜，用1×PBST(1×PBS，0.5‰ Tween-20)洗膜3次，每次5~10 min，将膜与相对应的抗体室温孵育1 h或4℃过夜，用1×PBST洗膜3次，每次5~10 min。然后将膜与二抗室温继续孵育1 h，1×PBST洗膜3次，每次5~10 min。用ECL试剂进行化学发光反应，ChemiDoc MP凝胶成像系统成像。上述孵育和洗膜过程均在水平摇床上进行。

1.3 统计学处理

所有实验均独立重复3次，实验数据以x±s表示，应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，两组之间的比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 X射线对TEC细胞迁移能力影响

如图 1所示2 Gy X射线照射TEC，24 h后划痕实验显示对照组细胞迁移距离为(78.89±24.67)像素，2 Gy照射组迁移距离为(114.37±35.12)像素，与对照组迁移距离相比，差异具有统计学意义(t=-3.311，P＜0.01)，说明2 Gy X射线可诱导TEC的迁移。

2.2 2 Gy X射线对Plk1 mRNA表达水平影响

培养TEC，2 Gy X线照射后24 h实时定量PCR检测对照组和照射组TEC中Plk1 mRNA表达。如图 2所示，对照组及2 Gy照射组中Plk1 mRNA表达水平分别为0.87±0.15、1.33±0.32，2 Gy照射组Plk1 mRNA表达水平显著升高(t=-4.434，P＜0.05)。

2.3 抑制Plk1激酶活性对STAT3及p-STAT3水平影响

取BI2536处理组和对照组TEC细胞做免疫印迹实验。如图 3所示，BI2536处理组p-STAT3Y705蛋白表达水平比对照组显著下降，总STAT3水平无显著差异。表明抑制Plk1激酶活性后p-STAT3 Y705表达被抑制。

2.4 2 Gy X线照射对Plk1、STAT3及p-STAT3表达水平影响

如图 4所示，2 Gy X射线照射TEC细胞后24 h，Plk1、p-STAT3Y705表达水平均显著升高，总STAT3水平无显著差异，表明2 Gy X射线照射能显著增加Plk1、p-STAT3Y705蛋白水平。

3 讨论

肝癌放射治疗后经常出现复发和转移，具体机制尚不清楚。近来研究报道电离辐射可通过影响肿瘤微环境、细胞-细胞连接、诱导上皮-间质转化等机制促进肿瘤细胞迁移和侵袭^[6]。Li T等^[7]发现TMPRSS4过表达促进上皮间质转化(EMT)在放射后诱导残留肝细胞癌转移中发挥重要作用。近年有研究报道miRNA在照射后肿瘤转移中发挥作用，闫位娟等^[8]发现4 Gy X射线照射诱导了miR-424-5p的表达并促进了A549细胞的侵袭和迁移。本研究则以肝癌血管内皮细胞为研究对象，对一定剂量X射线照射对其迁移能力影响及部分机制进行研究。

Plk1在多种肿瘤中过表达，近年研究发现Plk1能诱导上皮间质转化并通过活化CRAF/ERK信号促进细胞迁移和侵袭。在转移胰腺癌细胞中下调Plk1能增强细胞上皮特征并抑制细胞运动^[9]。为此本实验观察2 Gy X射线照射后TEC细胞迁移能力及Plk1表达水平的变化，研究发现2 Gy X射线照射TEC细胞迁移能力显著增强，同时伴有Plk1 mRNA表达水平显著升高，初步提示TEC受照后TEC迁移能力增强可能与Plk1表达升高有关。前期研究我们用Plk1 siRNA敲低TEC中Plk1，发现TEC的迁移能力显著降低^[10]，由此说明Plk1在TEC迁移中发挥重要促进作用。为进一步探讨是否STAT3在Plk1促进TEC迁移过程中发挥作用，本研究以Plk1激酶的抑制剂BI2536来抑制TEC细胞中Plk1激酶活性，发现p-STAT3较对照组显著降低，而总STAT3水平无显著变化，这与Zhang Y等^[11]报道的食管鳞状细胞癌中磷酸化的STAT3(p-STAT3)和Plk1表达呈正相关相一致。本研究发现2 Gy X射线照射后Plk1和p-STAT3Y705水平显著升高提示2 Gy X射线照射显著增强Plk1及p-STAT3Y705表达可能是其增强TEC迁移能力的重要分子机制之一。

原发性肝癌血供丰富，血管生成在其发生和侵袭中起关键作用，抗肝癌血管生成的药物研发在肝癌血管内皮细胞生成与抑制的理论基础上逐步开展，如贝伐单抗、索拉非尼、西妥单抗等药物在临床取得一定的疗效^[2]。抗血管生成已成为治疗肝癌的主要手段之一，Plk1及p-STAT3在TEC迁移中起促进作用，可作为抗肿瘤血管治疗的潜在分子靶点，该发现为抗血管生成药物的设计提供了新靶点，也为抗肝癌治疗提供了新思路。