血管性血友病因子(vWF)是一种主要由血管内皮细胞合成并分泌到血浆中的多聚体糖蛋白。在正常生理情况下，血浆中vWF多聚体与血小板结合，促进血小板粘附到内皮下结构，在止血的过程中发挥重要作用。此外，vWF可作为载体蛋白稳定凝血因子Ⅷ促进凝血因子的活化。在病理状态下，vWF促进血栓形成过程，因此被认为是动静脉血栓形成的危险因素之一。流行病学的研究发现，高浓度的vWF和低浓度的特异性vWF裂解酶(ADAMTS-13)是冠心病发病的重要危险因素^[1]。vWF基因在全身血管内皮中均有表达，并且几乎仅在血管内皮中表达，vWF绝大部分由内皮细胞合成并储存在Weibel-Palade小体内，其合成和释放与内皮细胞的内外部环境变化密切相关^[2]。血浆中vWF水平的变化可反映血管内皮细胞的损伤、异常活化或功能异常。因此，血浆中vWF的水平可用于临床的检测和评估。

X射线是在医学中有着广泛应用的一种电离辐射。高剂量的X射线会对人体造成损伤。临床患者需要接受多次X射线的照射，但辐照的剂量属于低剂量范围以内。本研究采用医用直线加速器对脐静脉内皮细胞进行0、0.1 Gy(剂量率为200 cGy/min)的X射线照射，然后对细胞进行细胞增殖、活力以及凋亡的检测，取细胞培养液，采用ELISA和Western方法检测受照细胞的vWF的分泌。

1 材料与方法 1.1 材料

人脐静脉内皮细胞(Manassas, VA, USA)、兔抗人单克隆抗体vWF (DaKo, Glostrup, Denmark)、MTT试剂盒(北京索莱宝)、台盼蓝染色液(Gibco)、细胞凋亡试剂盒(联科生物)、vWF酶联免疫试剂盒(Ramco Laboratories, Stafford, TX, USA)、Western电泳仪(美国BIO-RAD)、流式细胞仪(BD)、显影仪(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。

1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养及处理

细胞用DMEM高糖培养基(含10 %热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素)于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

1.2.2 X射线照射方式

采用美国Varian 21EX医用6 MV直线加速器，细胞培养板放置在1.5 cm等效蜡板上，源皮距100 cm，照射野10 cm×10 cm，剂量率200 cGy/min，总照射剂量分别为0、0.1 Gy。

1.2.3 MTT法

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，使用96孔平底板每孔加入100 μl，铺板后置于5% CO₂，37℃培养箱中孵育，细胞贴壁后即用医用直线加速器分别给予0、0.1 Gy(剂量率为200 cGy/min)的X线照射，实验组和对照组各设置3个复孔，继续置于5% CO₂，37℃培养箱中孵育24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5 % MTT)，继续培养4 h后吸去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，用摇床低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。

1.2.4 台盼蓝染色

分别以0、0.1 Gy(剂量率为200 cGy/min)的X线照射脐静脉内皮细胞，共设置3组对照实验，胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并做适当稀释，再将细胞悬液与0.4 %台盼蓝溶液(Gibco)以9:1混合混匀(终浓度0.04%)。三分钟内分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成蓝色，活细胞呈无色透明状。统计细胞活力：活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.2.5 细胞凋亡实验

分别以0、0.1 Gy(剂量率为200 cGy/min)的X射线照射脐静脉内皮细胞，共设置3组对照实验，胰酶消化贴壁细胞，用预冷PBS离心洗涤细胞2次，弃上清。取适量预冷1× Binding Buffer重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为1×10⁶~1×10⁷个细胞/ml，每个样品管中加入100 μl细胞悬液，约1×10⁵~1×10⁶个细胞/每管。每管加入5 μl Annexin V-APC和10 μl 7-AAD，轻柔涡旋混匀，室温避光孵育15分钟，每管加入380 μl预冷1×Binding Buffer。上机检测分析。

1.2.6 ELISA

贴壁的内皮细胞分别给予0、0.1 Gy(剂量率为200 cGy/min)的X射线照射，共设置6组对照实验。收取培养液，1075 rpm、4℃离心2 min，吸取上清，用PBS以1:20稀释，用vWF酶联免疫试剂盒检测培养液中vWF的表达水平。

1.2.7 Western blot检测

Western blot检测培养液中vWF蛋白表达，重复3次。提取总蛋白，SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，使用Bio-Rad成像系统成像，ImageJ软件进行灰度分析。

1.3 统计学处理

SPSS 17.0统计软件分析，计量资料采用x±s表示。实验组和对照组指标比较采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05，P＜0.05认为是有统计学差异。

2 结果 2.1 低剂量X射线处理不显著影响HUVEC细胞增殖、活力及凋亡

如图 1所示，MTT实验结果显示接受X射线照射的细胞少量增殖，但三次实验结果统计分析无显著性差别(P>0.05)；如图 2所示，台盼蓝染色结果显示接受X射线照射的细胞活力降低，但三次实验结果统计分析无显著性差别(P>0.05)；如图 3所示，细胞凋亡实验结果显示接受X射线照射的细胞少量凋亡，但三次实验结果统计分析无显著性差别(P>0.05)。

2.2 低剂量X射线对脐静脉内皮细胞分泌vWF的影响

如图 4所示，ELISA检测细胞培养基中vWF的分泌情况，接受0.1 Gy X射线照射的细胞培养液中vWF水平是对照组的3.67倍(P < 0.05)。图 5为Western条带以及灰度分析的结果，提取培养液总蛋白检测vWF水平，接受0.1 Gy X射线照射的细胞培养液中vWF水平是对照组的4.23倍(P < 0.05)。

3 讨论

血浆中vWF水平升高与多种疾病相关，如动脉粥样硬化、动静脉血栓形成等。长期以来，vWF主要被当作心肌梗死标志物或预测因子来研究。直到2012年底，Gandhi等在小鼠缺血再灌注模型中发现vWF基因敲除鼠中心肌缺血再灌注损伤显著减少，而特异性vWF裂解酶(ADAMTS-13)基因敲除鼠损伤明显增加^[3]。因此认为vWF是心肌缺血再灌注损伤的重要促损伤因素，也提示vWF可作为防治心肌缺血再灌注损伤的新靶点。

根据以往的实验研究，脐静脉内皮细胞在受到肿瘤坏死因子TNF-α刺激后分泌血管性血友病因子(vWF)增多，但细胞内的vWF水平并没有变化^[4]。本研究中，以0.1 Gy的低剂量X射线照射脐静脉内皮细胞后，并没有造成细胞增殖、细胞凋亡或影响细胞活性等，但细胞培养基中vWF水平明显升高，证明该剂量的X射线照射会使脐静脉内皮细胞分泌vWF增多。结果表明临床病人或医务工作者接受0.1 Gy的低剂量X射线照射虽然不会对身体造成明显伤害，但有可能会使血液中vWF水平升高，但具体的表达调节机制以及对人体的长远影响还需要进一步探索。