2. 山东省医学科学院放射医学研究所
2. Institute of Radiation Medicine, SDMS
巨噬细胞(Macrophages)是机体重要的固有免疫细胞，具有吞噬病菌和递呈抗原的作用，能够直接杀伤肿瘤细胞，也能激活细胞免疫进而清除肿瘤细胞。根据活化状态及功能将巨噬细胞分为两种极化群体：经典活化的M1型巨噬细胞和选择性活化的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞参与炎性反应，能够吞噬细菌、释放炎症介质、递呈抗原、启动免疫应答；M2型巨噬细胞抗原递呈能力较差，具有促进血管生成和组织重构的作用，被认为是抑炎性巨噬细胞。M2型巨噬细胞又可以分为三个亚群[1]：由IL-4或IL-13诱导的M2a亚群；免疫复合物/TLR诱导的M2b亚群以及IL-10和糖皮质激素诱导的M2c亚群。目前的研究中常用的M2型巨噬细胞的标志分子主要有YM-1和Arg-1。最近的研究发现：实体肿瘤中存在大量的巨噬细胞，约占总炎性细胞的30%~50%[2]，这些进入肿瘤组织的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages, TAMs)，TAMs通过调节肿瘤生长、血管和淋巴管生成、肿瘤基质重塑和免疫抑制方面在肿瘤复发和转移中发挥重要作用，肿瘤组织中TAMs的大量浸润与肿瘤的不良预后显著相关[3]。
放射治疗作为治疗肿瘤的重要手段之一，60%~70%的肿瘤患者在病程的不同时期接受放射治疗，尽管放射治疗设备和方法不断改进，但是仍有部分肿瘤经过一段时间放射治疗后复发或转移，其中涉及的机制尚未完全阐明。近年来研究发现：放射治疗后肿瘤组织周围聚集了较多的巨噬细胞，这些肿瘤相关巨噬细胞不但不能发挥正常的抗肿瘤作用，反而分泌细胞因子促进肿瘤血管和淋巴管生成，促进肿瘤生长、侵袭和转移[4]。
目前的研究证实：放射治疗后大量的TAMs前体细胞募集到肿瘤组织分化成TAMs，但是电离辐射后募集到肿瘤微环境中分化成的TAMs与肿瘤组织本身已经存在的TAMs功能存在差别[5]，提示辐射对巨噬细胞功能的影响，但是目前辐射诱导的TAMs与肿瘤局部原本存在的TAMs的功能差别尚未完全阐明[6]。本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象，通过探讨并比较IL-4诱导后给予电离辐射和IL-4诱导前给予电离辐射对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞M2型极化的影响，以模拟放射治疗时肿瘤局部已经存在的M2型巨噬细胞和放射治疗后肿瘤局部分化而成的M2型巨噬细胞，以期寻找两者的表型及功能差别为肿瘤的放射治疗提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(江苏凯基生物技术股份有限公司)、鼠源重组白细胞介素4(rIL-4，novoprotein)、抗鼠CD206单克隆荧光抗体(eBioscience)、抗鼠CD209单克隆荧光抗体(eBioscience)、Anti-Liver Arginase抗体(abcam)、Anti-Ym-1+Ym-2抗体(abcam)；流式细胞仪(BD)、Western电泳仪(美国BIO-RAD)。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养及处理细胞用DMEM高糖培养基(含10%热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素)于37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.2.2 X射线照射方式采用美国Varian 21EX医用6 MV直线加速器，细胞培养板放置在1.5cm等效蜡板上，源皮距100 cm，照射野10 cm×10 cm，剂量率400 cGy/min，照射剂量梯度为0 Gy、2 Gy、5 Gy、10 Gy。
1.2.3 处理方式第一组X射线照射细胞24 h后给予10 ng/mL IL-4刺激12 h后流式细胞仪检测CD206、CD209，Western blot检测Arg-1和YM-1；第二组10 ng/mL IL-4刺激细胞3h后X射线照射9 h后流式细胞仪检测CD206、CD209，Western blot检测Arg-1和YM-1。
1.2.4 流式细胞术检测分别采用PE标记抗CD206，FITC标记抗CD209单抗处理细胞，流式细胞术检测细胞表面CD206和CD209的表达，重复3次，Cellquest软件分析结果。
1.2.5 Western blot检测Western blot检测Arg-1和YM-1蛋白表达，重复3次。提取总蛋白，SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，使用G:BOX chemiXR5成像，Gel-Pro32软件进行灰度分析。
1.3 统计学处理SPSS 17.0统计软件分析，计量资料采用x±s表示。不同受照剂量各指标的比较首先进行方差齐性检验，方差齐后采用单因素方差分析，有统计学意义后采用Bonfferoni法进行两两比较。相同受照剂量两种受照方式的指标比较采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05，P＜0.05认为是有统计学差异。
2 结果 2.1 辐射上调IL-4诱导的巨噬细胞YM-1和Arg-1表达如图 1和图 2所示，先照射后IL-4诱导细胞时(RT+IL-4)，5 Gy和10 Gy照射剂量下YM-1表达高于未照射对照组(P＜0.01；P＜0.001)，10 Gy照射剂量下Arg-1表达高于未照射对照组(P＜0.001)；IL-4诱导细胞后照射时(IL-4+RT)，2 Gy、5 Gy和10 Gy照射剂量条件下YM-1和Arg-1均高于未照射对照组(P＜0.01；P＜0.001；P＜0.001)。
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图 1 免疫印迹分析照射对IL-4诱导的RAW264.7细胞YM-1和Arg-1的表达影响 |
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图 2 照射对IL-4诱导的RAW264.7细胞YM-1和Arg-1的表达的柱状图分析 注：**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。 |
比较不同处理方式，相同照射剂量下对IL-4诱导的巨噬细胞Arg-1和YM-1表达的影响，如图 3所示，2Gy和5Gy照射剂量条件下，IL-4+RT组Arg-1表达高于RT+IL-4组(P＜0.001；P＜0.01)；2 Gy、5 Gy和10 Gy照射剂量条件下，IL-4+RT组YM-1表达高于RT+IL-4组(P＜0.01；P＜0.001；P＜0.001)。
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图 3 不同照射方式对IL-4诱导的小鼠RAW264.7细胞YM-1和Arg-1表达的柱状图分析 注：**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。 |
如表 1和图 4所示，两种处理方式下，不同照射剂量条件下，CD206和CD209的表达均显著下调(3次实验的x±s)。如图 5所示，先照射后加IL-4刺激组(RT+IL-4组)，不同受照剂量下CD206(P < 0.001; P < 0.01; P < 0.001)和CD209(P < 0.001; P < 0.01; P < 0.001)表达显著下调，先加IL-4刺激后再进行照射组(IL-4+RT组)，不同受照剂量下CD206(P < 0.001; P < 0.01; P < 0.001)和CD209(P < 0.001; P < 0.01; P < 0.001)表达均显著降低，并具有剂量依赖性。
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表 1 不同受照剂量/方式对IL-4诱导的小鼠RAW264.7细胞CD206和CD209的表达(x±s) |
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图 4 流式细胞术分析照射对IL-4诱导的小鼠RAW264.7细胞CD206和CD209的表达 注：三次实验结果取其中一次流式结果。 |
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图 5 照射对IL-4诱导的小鼠RAW264.7细胞CD206和CD209表达的柱状图分析 注：**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。 |
我们比较相同受照剂量下，不同的照射方式巨噬细胞CD206和CD209的表达，结果如图 6所示：5 Gy和10 Gy照射剂量下，IL-4+RT组CD206的表达高于RT+IL-4组(P < 0.001; P < 0.001)；2 Gy、5 Gy和10 Gy照射条件下，IL-4+RT组CD209的表达高于RT+IL-4组(P < 0.001; P < 0.01; P < 0.001)。
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图 6 不同照射方式对IL-4诱导的RAW264.7细胞CD206和CD209表达的柱状图分析 注：**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。 |
TAMs并不是一成不变的，而是处于动态变化的一群细胞，M1/M2型巨噬细胞比例平衡与其所处的细胞因子环境、肿瘤内部乏氧程度、肿瘤的分型、分期及治疗等因素密切相关[6]。研究证实：细胞所在的微环境会影响M1/M2型巨噬细胞比例平衡，在LPS、TNF-α和IFN-γ等因子的作用下，巨噬细胞向M1型极化，在IL-4、IL-13、IL-10和TGF-β等因子作用下，巨噬细胞向M2型极化，Arg-1和YM-1是M2型巨噬细胞标志分子。M1型参与炎症的发生，M2型参与肿瘤的发生，有研究发现，随着肿瘤的发展，肿瘤组织中的TAMs最终表现为以M2型为主[7-8]。
本课题首次研究不同照射剂量以及不同放射方式对IL-4诱导巨噬细胞向M2型极化过程的影响，有研究指出IL-4刺激RAW264.7 12h后，Arg-I在mRNA水平显著升高[9]，我们的研究发现射线作用于IL-4诱导的巨噬细胞后，Arg-1和YM-1表达均比未照射显著上升，提示电离辐射促进IL-4诱导的巨噬细胞向M2型极化。有研究指出：在体外实验中，未分化巨噬细胞受到中等剂量(1~10 Gy)的电离辐射照射后向M1型极化，能促使LPS/IFN-γ诱导的M1型极化的巨噬细胞M1型标志物增高，但是中等剂量的电离辐射并未显著改变M-CSF和IL-10诱导的M2型极化的巨噬细标志物表达水平[10]。我们的研究证实中等剂量(1~10 Gy)照射上调IL-4诱导的M2型巨噬细胞标志分子YM-1和Arg-1的表达。此外，我们的研究发现：照射前加IL-4诱导巨噬细胞比加IL-4诱导巨噬细胞后照射，YM-1和Arg-1的表达显著升高，提示我们肿瘤局部已经存在M2型巨噬细胞与照射治疗后肿瘤局部新生的M2巨噬细胞不同，前者YM-1和Arg-1的表达更强。
不同剂量和不同方式照射后，IL-4诱导的巨噬细胞CD206、CD209均下降，提示照射后细胞功能整体受抑制的状态，这与周传丰和金顺子等人的研究结果相似，周传丰等用大剂量γ射线照射DC细胞导致免疫抑制[11]，金顺子等人的研究发现，J774A.1细胞在接受2、4、6 Gy照射后，CD80和CD86表达均受抑制[12]，小鼠受到6.0 Gy照射时，腹腔巨噬细胞无从诱导免疫反应，CD80和CD86表达均未增高，提示巨噬细胞照射后功能受抑制[13]。此外，虽然不同的照射方式均下调CD206和CD209表达，但我们的研究发现：照射前加IL-4诱导巨噬细胞比加IL-4诱导巨噬细胞后照射，CD206和CD209的表达较高，提示我们肿瘤局部已经存在M2型巨噬细胞与照射治疗后肿瘤局部新生的M2巨噬细胞不同。综上所述，目前电离辐射对巨噬细胞极化影响及内在机制仍需进一步研究。
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