四君子汤为我国传统中药复方，源于宋代《太平惠民和剂局方》，由人参(或党参)、白术、茯苓、甘草组成，功效为益气健脾、主治脾胃气虚等症^[1]。现代药理学研究表明，四君子汤具有多种药理活性，如调节慢性心衰大鼠心肌组织多种蛋白表达以改善心功能^[2]，提高机体免疫功能^[3]，抑制胃癌细胞株增殖^[4]等。中医理论认为，四君子汤方中君药如用人参，为取其大补元气，健脾养胃之效，如用党参，则为取其生津养血、补中益气之效。在对四君子汤的药理研究及临床使用中，也存在多种药物配比，常见的有10: 9: 9: 6^[5]、2: 2: 2: 1^[6]等，中国药典^[1]规定，方中君药为党参、药物配比为2: 2: 2: 1。而目前在四君子汤辐射防护作用研究方面，未见不同君药、不同配比四君子汤的比较研究。为深入探讨四君子汤的抗辐射活性并为临床使用四君子汤进行抗辐射治疗提供科学依据，本次实验采用多个活性指标，通过体内和体外实验，探讨了不同君药、不同配比的四君子汤的辐射损伤防护作用。

1 材料与方法 1.1 仪器、材料与主要试剂

FACSCalibur型流式细胞仪，购自美国BD公司；Multiskan GO型酶标仪，购自美国Thermo公司；BH-2型显微镜，购自日本Olympus公司；Axiocam ERC5S型倒置显微镜，购自德国ZEISS公司；5810 R型离心机，购自德国Eppendorf公司；water Jacket型CO₂孵箱，购自美国Thermo公司；DZF-6030A型真空干燥箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；TP-214型分析天平，购自丹佛仪器(北京)有限公司；Milli-Q A10型纯水仪，购自美国Millipore公司；cell counting kit-8细胞增殖-毒性检测试剂盒，购自东仁化学科技(上海)有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，购自美国BD公司。

1.2 试药

人参、党参、白术、茯苓、甘草等生药饮片，购自北京德威治大药房。将人参(10)、白术(9)、茯苓(9)、甘草(6)置于回流加热装置中，第1次加入约10倍量蒸馏水，浸泡0.5 h，武火煮沸后，文火(保持微沸状态)煎2 h；60目筛网滤过，药材再加约10倍量蒸馏水，武火煮沸后，文火(保持微沸状态)煎1h。合并2次水煎液，水浴浓缩后60℃真空干燥为粉末，作为人参四君子汤水提取物A，得率为42%(药A)。将人参(2)、白术(2)、茯苓(2)、甘草(1)置于回流加热装置中，同法得人参四君子汤水提取物B，得率为42%(药B)。将党参(2)、白术(2)、茯苓(2)、甘草(1)置于回流加热装置中，同法得党参四君子汤水提取物，得率为48%(药C)。

1.3 细胞与培养体系

正常人淋巴母细胞AHH-1细胞系，由本实验室保存，悬浮成簇生长，倍增时间16~19 h。细胞培养于RPMI-1640培养液(含10%FBS，1%青-链双抗)，37℃，5%CO₂孵箱，2~3 d更换培养液并传代。

1.4 照射条件

北京师范大学化学学院钴源⁶⁰Co γ射线照射，细胞单次吸收剂量为4.0 Gy，小鼠单次全身照射的吸收剂量为3.5 Gy，剂量率均为1.0 Gy/min，源靶距1.15 m。

1.5 药物的细胞毒性检测

取对数生长期的AHH-1细胞接种于96孔板，每孔3×10⁴个，每组设6个复孔。加入不同终浓度(见图 1)的药A、药B、药C(以四君子汤生药量计)，作用细胞48h。设细胞对照孔和培养液对照孔。用CCK-8试剂盒，按照试剂盒说明书操作。酶标仪测定各孔吸光度D(450)，按下式计算细胞存活率。

细胞存活率(%)=[检测组D(450)-培养液对照孔D(450)]/[细胞对照组D(450)-培养液对照孔D(450)]×100%

1.6 药物预处理对γ射线照射后AHH-1细胞的影响

取对数生长期的AHH-1细胞接种于96孔板，每孔2×10⁴个，每组设6个复孔。加入不同终浓度(见图 2)的药A、药B、药C(以四君子汤生药量计)，作用2 h，再经4 Gy γ射线照射。设细胞对照孔和培养液对照孔。照后继续培养48h，用cell counting kit-8细胞增殖-毒性检测试剂盒，按照试剂盒说明书操作。方法同1.5。

1.7 实验动物、分组及给药方案

BALB/c小鼠120只，SPF级，雌雄各半，6~8周，体重(18±2)g，购自北京维通利华实验动物有限责任公司，实验动物使用许可证号SCXK (京)2012-0001。在中国疾病预防控制中心职业卫生所动物实验室饲养，动物实验设施使用许可证号SYXK(京)2014-0043，饲养条件为光照12 h，饲养温度23℃~26℃，湿度40%。小鼠适应性喂养1d后按体重编号，按随机数字表法进行完全随机化分组，设阴性对照组、照射对照组、药A、药B、药C组，每组24只。按临床人用剂量推算四君子汤小鼠给药剂量为2.25 g/kg(以四君子汤生药量计)，因此按提取部位得率计算给药剂量：药A组为0.95 g/kg，药B组为0.95 g/kg，药C组为1.08 g/kg。给药方案为照前7 d给药，照后7 d给药，每天给药1次，0.4 mL/只，灌胃给药。阴性对照组和照射对照组给予等体积的纯水。

1.8 受照小鼠体重观察

照前1d、照后3、7 d，对各组小鼠称重，观察体重变化。

1.9 受照小鼠胸腺及脾脏系数检测

小鼠接受全身一次性3.5 Gy γ射线照射，照射后3 d和7 d，称得小鼠体重，然后颈椎脱臼法处死小鼠，取胸腺及脾脏，称重，按下式计算脏器系数：

$ 胸腺\left( {脾脏} \right)系数 = \frac{{胸腺\left( {脾脏} \right)重量\left( {{\rm{mg}}} \right)}}{{体重\left( {\rm{g}} \right)}} $

1.10 受照小鼠骨髓嗜多染红细胞微核计数

小鼠接受全身一次性3.5 Gy γ射线照射，照射后3 d和7 d，颈椎脱臼法处死小鼠，取胸骨，用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片。涂片自然干燥后放入甲醇中固定5~10 min。将固定好的涂片放入Giemsa应用液中，染色10~15 min。立即用纯水冲洗，晾干，镜检。选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域，在油镜下观察。记录约1000个嗜多染红细胞，计算微核率。

1.11 受照小鼠脾细胞凋亡检测

小鼠接受全身一次性3.5 Gy γ射线照射，照射后3 d和7 d，颈椎脱臼法处死小鼠。取脾脏，称量后立刻用PBS液冲洗，用磨砂玻璃棒在细胞过滤筛(200目)上轻轻研磨去除表面结缔组织，收集细胞悬液，用PBS液洗涤2次，以离心半径17.8 cm，2000 r/min常温离心5 min，弃上清液。上机前以红细胞裂解液处理，PBS液洗涤细胞2次，以离心半径17.8 cm，2000 r/min常温离心5 min，制成约1×10⁵/mL细胞悬液，按照试剂盒说明书操作。流式细胞仪测定各组脾细胞凋亡率。

1.12 统计学方法

实验数据采用平均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析。各组数据进行正态性和方差齐性检验，两组之间差异采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 药物对AHH-1细胞的毒性检测

药A、药B、药C单独作用AHH-1细胞48h结果表明，终浓度在0~1000 μg/mL(以四君子汤生药量计)范围内对AHH-1未见明显毒性(图 1)。

2.2 药物预处理对γ射线照射后AHH-1细胞的影响

根据药物的细胞毒性检测结果，分别用终浓度0、31.3、62.5、125、250、500、1000 μg/mL(以四君子汤生药量计)的药A、药B、药C作用AHH-1细胞2 h后，经4 Gy γ射线照射，照后继续培养48h，检测细胞的存活率，如图 2。从图 2可以看出，经不同君药、不同配比的四君子汤处理，与对照组细胞(0 μg/mL)相比，经250 μg/mL药C处理的细胞，存活率显著提高(P < 0.05)。提示药C对照射后的AHH-1细胞具有明显的保护作用。

2.3 试药对3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射小鼠体重的影响

照射前，各组小鼠毛色及活动正常，体重稳定。接受照射后0~7 d，阴性对照组小鼠保持正常，照射对照组及药A至药C组均出现不同程度的皮毛光泽下降，精神萎靡，饮食及饮水量下降。照前1 d、照后3、7 d，对各组小鼠称重，体重变化趋势见表 1。照前1 d，与照射对照及阴性对照组比较，药A、药C组小鼠体重升高，差异均具有统计学意义(P < 0.05), 提示连续给药6 d，可以有效促进小鼠体重增加。照后3 d及7 d，与阴性对照组比较，照射组小鼠体重显著降低(P < 0.05)，提示经3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射后，小鼠机体严重受损。照后3 d，与照射对照组相比，药B、药C组小鼠体重显著升高(P < 0.05)。照后7 d，各组小鼠体重表现出不同程度的恢复，但与照射对照组比较，差异无统计学意义(表 1)。

2.4 试药对3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射小鼠胸腺系数的影响

经过3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射后，与阴性对照组比较，各组小鼠的胸腺系数显著降低——照后3 d及照后7 d，差异均具有统计学意义(P < 0.05)，说明受照小鼠胸腺严重受损。照后7 d，与照射对照组比较，药A、药B组小鼠的胸腺系数显著升高(P < 0.05)。提示药A、药B可有效减轻受照小鼠胸腺的损伤，增加胸腺重量(表 1)。

2.5 试药对3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射小鼠脾脏系数的影响

经过3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射后，与阴性对照组比较，各组小鼠的脾脏系数显著降低——照后3 d及照后7 d，差异均具有统计学意义(P < 0.05)，说明受照小鼠脾脏严重受损。照后7 d，与照射对照组比较，药B组小鼠的脾脏系数显著升高(P < 0.05)。提示药B在抑制受照小鼠脾脏的损伤，促进脾脏细胞增殖，增加脾脏重量方面具有一定的作用(表 1)。

2.6 对受照小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响

照后3 d及7 d，与阴性对照组相比，照射对照组小鼠的骨髓嗜多染红细胞中微核数量显著增加(P < 0.05)，说明受照小鼠的微核率受到γ射线的明显影响。与照射对照组相比，照后3 d，药A、药B、药C组小鼠的微核率均显著降低(P < 0.05)，其中药B组的数值最低；照后7 d，药B、药C组小鼠的微核率均明显下降(P < 0.05)。提示药A、药B、药C均能有效降低受照3 d及7 d小鼠的微核率，其中药B作用最为明显。结果见表 1。

2.7 试药对3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射小鼠脾细胞凋亡的影响

照后3 d，与阴性对照组相比，照射对照组小鼠的脾细胞死亡细胞率、中晚期凋亡率、总死亡凋亡率均显著上升(P < 0.05)；与照射对照组比较，药A、药B、药C组的脾细胞死亡细胞率、中晚期凋亡率、总死亡凋亡率均显著降低(P < 0.05)，药B组的早期凋亡率显著下降(P < 0.05)，其中药B组的死亡细胞率、总死亡凋亡率数值最低。照后7 d，与阴性对照组相比，照射对照组小鼠的脾细胞死亡细胞率、中晚期凋亡率、早期凋亡率、总死亡凋亡率均显著增加(P < 0.05)；与照射对照组比较，药A、药B、药C组的脾细胞早期凋亡率、总死亡凋亡率，药B、药C组的死亡细胞率，药A、药B组的中晚期凋亡率均显著下降(P < 0.05)，其中药B组的死亡细胞率、总死亡凋亡率数值最低。提示药A、药B、药C对于3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射小鼠的脾细胞凋亡均有显著的抑制作用，其中药B(2: 2: 2: 1)的作用最明显(表 2)。

3 结果与讨论

在临床应用四君子汤时，方中君药主要是人参、党参，其它品种如西洋参、太子参等也有少量应用，药物配比也存在多种方案，代表性的配比为10: 9: 9: 6^[5]和2: 2: 2: 1^[6]。中医理论对不同君药四君子汤的治疗作用进行了阐述，而本文从现代药理学角度对2种君药，3种药物配比的四君子汤的电离损伤辐射防护作用进行了探讨，对不同君药、不同配比的四君子汤的抗辐射活性进行了初步评价，为四君子汤的临床应用提供了科学参考。本次实验以人临床使用剂量推算小鼠给药生药剂量并以此剂量作为各组的给药生药剂量，然后通过不同君药、不同配比的四君子汤的提取得率计算给药剂量，确保了各组实验结果的可比性。

淋巴母细胞AHH-1是机体内特异性免疫细胞并具有较高的照射敏感性，胸腺和脾脏均属于电离辐射高度敏感器官，与造血和免疫应答关系密切，胸腺和脾脏受照产生损伤，将对机体的免疫、造血系统带来严重后果^{[7, 8]}，辐射还可导致骨髓嗜多染红细胞微核率增加^[9]。淋巴母细胞AHH-1存活率下降以及机体的胸腺、脾脏系数降低、骨髓嗜多染红细胞微核率升高、脾细胞凋亡率上升均为一次性γ射线照射引起机体辐射损伤的主要表现，因此检测上述指标可有效评价药物的抗电离辐射损伤的作用。

体外实验结果显示，党参四君子汤(2: 2: 2: 1)对4 Gy ⁶⁰Co γ射线照射的AHH-1细胞具有明显的保护作用。体内实验结果显示人参四君子汤(10: 9: 9: 6)可显著降低3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射小鼠的胸腺系数、显著降低脾细胞凋亡率及骨髓嗜多染红细胞微核率，党参四君子汤(2: 2: 2: 1)可显著降低脾细胞凋亡率及骨髓嗜多染红细胞微核率。而人参四君子汤(2: 2: 2: 1)可显著升高受照小鼠的胸腺、脾脏系数，显著降低受照小鼠的脾细胞凋亡率及骨髓嗜多染红细胞微核率，并且微核率及死亡细胞率、总死亡凋亡率数值最低，这表明人参四君子汤(2: 2: 2: 1)可有效抑制受照小鼠的电离辐射损伤且效果最佳。另外，在机体的辐射损伤表现中，体重减轻是最直观且明显的观察指标，在预防性给药期间，人参四君子汤(10: 9: 9: 6)组及党参四君子汤(2: 2: 2: 1)组小鼠体重增加显著，治疗性给药期间，受照小鼠体重显著下降，人参四君子汤(2: 2: 2: 1)、党参四君子汤(2: 2: 2: 1)均能有效促进3.5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射损伤小鼠体重的恢复，这可能是与四君子汤中补气、补血的药物尤其是人参、党参对机体的温补作用有关。

总体而言，不同君药、不同配比的四君子汤的抗辐射药效比较，在相同配比下，人参作为君药，药效好于党参；不同配比下，人参(2: 2: 2: 1)抗辐射药效优于人参(10: 9: 9: 6)。这表明，在相同配比下，人参的大补元气，健脾养胃之效，与党参的生津养血、补中益气之效比较，对于辐射所致机体的免疫和造血功能损伤可能具有更佳的恢复作用。而在不同配比下，提高白术、茯苓在复方中的比例，可能也有助于提高免疫能力，保护造血组织免于辐射诱发的损伤。当然，四君子汤中的化学成分是非常复杂的，对其抗辐射活性的研究也还需要采用更多的活性指标加以佐证，上述推论还有待更深层次的研究。同时，实验结果表明，人参四君子汤(10: 9: 9: 6)对于小鼠的电离辐射损伤也具有良好的效果，党参四君子汤对于抑制电离辐射损伤特别是受照小鼠的脾脏损伤，也具有一定的作用，这验证了10: 9: 9: 6的药物配比及党参作为方中君药的可行性。

综上所述，本次实验结果验证了人参作为君药以及药典规定药物配比为2: 2: 2: 1的合理性，同时表明党参四君子汤在辐射损伤防治方面也起到一定的作用，使用党参四君子汤进行辐射防护是可行的。本次结果为优化四君子汤的制备工艺，四君子汤药效的深入研究提供了重要参考依据。本课题组目前正在对四君子汤的抗辐射活性部位进行深入研究，以期明确四君子汤的抗辐射活性成分，为开发高效低毒、成分明确、质控稳定的新型四君子汤制剂产品提供科学依据。