“蛋白组学”(proteomic)一词最早由澳大利亚科学家Wilkins和Williams在1994年提出，源于蛋白质与基因组两个词的组合，是指一种基因组所表达的全部蛋白质^[1]。蛋白质组学是在整体水平上研究蛋白质特性，包括蛋白质的表达、翻译后修饰以及蛋白质间的相互作用。在细胞生理及病理发生的过程中，蛋白质组学技术可以作为揭示其分子及细胞调节机制的研究方法。蛋白质组学技术在辐射研究中的应用日益增加，为了更好地研究辐射引起的分子生物学效应，大量的蛋白质组学的研究数据将被集成到放射生物学领域。

1 蛋白组学技术

蛋白质组学不仅研究蛋白质的表达，还包括蛋白质的功能、结构、修饰和相互作用，一些相关技术已经建立。蛋白质组学技术主要用于蛋白质定量分析和蛋白质组定性分析。蛋白质组学的方法可以分为两大类:基于凝胶(一或二维凝胶电泳)和无凝胶(液相色谱)方法^[2]。质谱通过无标签或标签技术进行蛋白质鉴定。下面将对蛋白组学技术作一个简单介绍。

1.1 双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)

双向电泳就是利用蛋白质所带电荷及分子量这两项特征使蛋白质能够有效分离。双向电泳的第一向为等电聚焦电泳，是根据蛋白质所带的电荷量将其分离; 第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据蛋白质的分子量而将其分离。蛋白质经双向电泳分离后产生一系列的蛋白点，通过这种方法在一块胶上能分离出几千种蛋白质，具体取决于蛋白质的等电点、表观分子量以及蛋白质的相对丰度。而且，双向电泳能按照蛋白翻译后修饰的不同而分离蛋白质。荧光差异双向电泳(2D-DIGE)是在双向电泳的基础上，使用三种荧光染料(Cy2、Cy3、Cy5)标记不同组别的蛋白，并在同一张凝胶上对标记的3种蛋白质混合物同时进行电泳的多路线分离技术。2D-DIGE是由起源于上个世纪70年代的双向凝胶电泳技术改造而成^[3]。其中Cy3和Cy5分别标记两组样本的蛋白，Cy2标记所有组别蛋白的混合物，作为内参使用。电泳分离后，在激光扫描仪中使用三种不同波长的激光进行扫描，在同一张凝胶中可得到三组蛋白的图谱。利用比对软件，给出各组间蛋白质的准确定量信息; 借助于质谱仪，还可以定性差异蛋白质。2D-DIGE技术巧妙地解决了2-DE重复操作而引起的系统误差，具有灵敏性高、重复性好等特点。

1.2 质谱技术(Mass pectrometry，MS)

质谱仪是测定由分子衍生的离子质量的分析仪器。MS的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间的质量与电荷比值的差异分离并确定分子量。质谱仪主要有三部分组成:离子源、质量分析器和检测器。由于电离技术的制约，在很长的一段时间里，MS只能对小分子进行准确、灵敏的测定。20世纪80年代后，由于两种软电离技术的出现，才使MS有了现在的应用前景。这两种软电离技术就是基质辅助激光解吸电离(Matrix assisted laser desorption-ionization，MALDI)和电喷雾电离(Electrospray ionization，ESI)。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF -MS)是MALDI离子源与飞行时间质量分析器(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)相结合。其原理将待测蛋白样品溶液与过量小分子基质(1: 100 ~ 5000)溶液混合，然后取微量混合液点到样品靶上，经过加热或者风吹烘干形成共结晶，放入离子源内引起蛋白质电离和气化，样品被离子化后由高电压将其传送到质量分析器-时间飞行质谱仪内。在那里它们与基质分子分离，然后根据它们各自的质量与电荷比被检测，获得质量指纹谱图。MALDI-TOF-MS还能够应用于研究蛋白质翻译后修饰和蛋白质之间的相互关系。采用MALDI-TOF -MS测定肽指纹图谱是当前蛋白质组研究的常用鉴定方法，蛋白质无需纯化，并可同时鉴定多个蛋白质，具有灵敏度高、准确度高、自动化程度高的特点，是蛋白质组学的一个重大突破。此外，近几年来，以信息为基础的评分功能可以快速选择候选评分最高的蛋白质，使鉴定精度大为提高^[4-5]。

1.3 同位素的相对量和绝对量(Isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ)

iTRAQ是最近新开发的化学标签技术^[6]。iTRAQ定量蛋白质组学是蛋白酶切后形成多肽，用iTRAQ同位素试剂标记多肽N末端或赖氨酸侧链基团。标记后的肽段经过液相分离，进行一级质谱和二级质谱分析，在二级质谱前，被标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比和其他理化性质。而在二级质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114 ~ 121)的峰，根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。iTRAQ试剂包括三部分:报告部分、肽反应部分、平衡部分。报告部分有八种，113-121(无120)，因此iTRAQ试剂可同时标记8组样品。肽反应部分能与肽段N端及赖氨酸侧链氨基发生共价连接而标记上肽段。平衡部分保证被标记的同一肽段的质荷比相同。与传统的双向电泳定量分析相比，iTRAQ具有灵敏度高、分离能力强、分析范围广、高通量、自动化程度高等优势。

1.4 同位素亲和标签(Isotope-coded affinity tag，ICAT)

ICAT是用同位素进行体外标记的方法。ICAT中的蛋白标签含有三个功能区，分别是半胱氨酸反应区、含八个氢和八个氘的连接臂以及生物素区，通过这种技术可以将两种不同状态细胞的蛋白混合物中的半胱氨酸侧链分别用上述轻链试剂和重链试剂还原、烷基化。将两种标记物混合后进行胰酶消化。使用抗生素亲和柱纯化获得含有半胱氨酸的多肽，可以使蛋白混合物简化到原混合物的十分之一。这些多肽通过质谱分析可同时获得两种同位素的相对丰度数据，然后通过肽分子量MS/MS获得氨基酸序列进行蛋白质鉴定。

1.5 细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)

SILAC是蛋白质组学定量研究领域的一个重大发现，SILAC，这种复杂而精确的蛋白质组学方法建立于十多年前，多年来已成为体内和体外的蛋白质组学研究的一种最适用的方法^[7]。其基本原理是分别采用含有轻、中或重型同位素必需氨基酸的培养基培养细胞(用于SILAC的稳定同位素氨基酸主要有Lys和Arg)，新合成的蛋白质即嵌合了同位素氨基酸，如此培养5 ~ 6代后，细胞的所有蛋白质均被同位素标记上。经处理因素刺激后，等量混合各类型蛋白质，然后经SDS-PAGE分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中同位素峰型的面积大小进行相对定量，同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。由于SILAC标记技术是体内标记技术，几乎不影响细胞的功能，同时灵敏度高，因此其在蛋白质组学相关领域中得到了广泛的应用，如比较蛋白质组学、蛋白质与蛋白质相互作用、蛋白质与DNA相互作用、蛋白质与RNA相互作用等。与体外标记技术相比，SILAC属于体内标记，具有高通量、定量精确、线性定量范围广、灵敏度更高等优势。

1.6 生物信息学

生物信息学是一门交叉科学，它包含了生物信息的获取、加工、存储、分配、分析、解释等在内的所有方面，它综合运用数学计算机科学和生物学的各种工具，来阐明和解释大量数据所包含的生物学意义^[8]。蛋白质图谱有成千上万个点，如此大的信息量需要相应完善的处理软件和建立专门的数据库才能进行快速的搜索和蛋白质的鉴定，因此在蛋白质组研究中生物信息学具有重要作用。目前应用最普遍的数据库是NRDB数据库，NRDB是由NCBI创建的，是NCBI的BLAST搜索程序的默认蛋白质序列数据库。NRDB是由GenPept(由GenBank编码序列自动翻译而成数据库)、PDB序列、PIR和SWISS-PROT等几个数据库组成。计算机分析软件主要有蛋白质双向电泳图谱分析软件(Z3、Melanie Ⅲ、PDQUEST、Image Master 2D等)、蛋白质鉴定软件(FRAGFIT、PeptideSearch、Mascot、SEQUEST)、蛋白质功能分析软件(Go analysis)等。

2 蛋白质组学技术在辐射研究中的应用

电离辐射作为癌症和非癌症疾病的危险因素，仍然是影响人体健康问题之一。辐射诱导细胞产生的复杂分子效应，以往的放射生物学研究为辐射诱导的分子效应研究提供了有价值的信息，但其参与病理生理发生发展的潜在分子机制尚不清楚。辐射效应，如损伤效应、兴奋性效应、适应性反应、旁效应和基因组不稳定性等，其中适应性反应、旁效应、和基因组不稳定性都挑战着细胞DNA损伤依赖放射剂量累积这一模式，低剂量辐射诱导的适应性反应最能说明这个问题。低剂量辐射诱导适应性反应是辐射研究中的热点。低剂量辐射诱导的适应性反应是指细胞在经受一定的低剂量(< 10 cGy)辐射刺激后，对继发的较高剂量(> 100 cGy)辐照损伤或内源性损伤产生一定的抗性^[9]。目前已经提出了几条与适应性反应相关的假说。LDR诱导的适应性反应激活DNA损伤修复系统和修复酶的机制^[10-11]，后续的研究发现DNA双链断裂的修复系统参与了适应性反应^[12-13]。LDR诱导的适应性反应激活抗自由基和抗氧化系统，淋巴细胞先经过低剂量γ射线预照射后细胞内主要抗氧化酶如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等活性均高于直接接受高剂量γ射线照射的细胞组^[14]。Imai R^[15]在研究人外周血原始神经外胚层瘤(pPNET)细胞凋亡的信号通路时发现对pPNET进行低剂量辐射4h后，利用WB发现p53、P21WAF-1和Bax表达增加，Bcl -2的表达减少。提示LDR诱导基因和蛋白质表达。LDR不仅可以激活某些基因，还可引起蛋白质表达的变化^[13-16]。

2.1 蛋白组学技术在低剂量辐射诱导适应性反应研究中的应

用目前在研究低剂量辐射诱导适应性反应机制中，蛋白质组学方法的应用是必不可少的，蛋白质组学技术在适应性反应中的应用主要有一下几个方面。低剂量辐射对机体的生物效应表现在免疫、血液等多个系统和基因、蛋白等多个层面，有必要用更高通量的方法全面地分析其发生机制。因此用双向电泳技术对低剂量照射组及假照射组的蛋白质表达差异进行分析，从蛋白质水平上探讨低剂量辐射对机体的作用机制，有利于发现与低剂量辐射作用机制相关的蛋白质，为低剂量辐射作用机制的研究提供实验依据。李薇^[20]等利用双向电泳技术研究发现低剂量辐射后血清中维生素D结合蛋白表达上调，低剂量辐射后血清中维生素D结合蛋白的表达增加，从而影响了信号的传导、基因的表达，可能产生某些保护性蛋白质，而发生生物学效应。Olivier Guipaud^[21]等研究者利用2D-DIGE发现小鼠的血液中的蛋白经过照射后有20多个蛋白发生了变化，它们分别是补体-3、肌动蛋白、血红素、载脂蛋白、拮抗蛋白等。根据分析蛋白质的迁移率和荧光颜色发现有少数蛋白质在照射后发生了蛋白质翻译后修饰。

在鉴定低剂量辐射诱导的适应性反应的蛋白质时，双向电泳技术是常用的方法，对于双向凝胶上的蛋白点的鉴定，MALIDI-TOF-TOF因为它的高敏感性和高通量是目前蛋白质鉴定的首选方法^[22]，蛋白样品首先要经过蛋白酶酶解成肽段，然后利用MS来测定肽段碎片的质量，肽段碎片为目标蛋白提供了肽质量指纹图谱(Peptide mass fingerprinting，PMF)，并且不受蛋白翻译后修饰的影响(PTM)。在以往的研究当中，研究者Bhakti Basu^[23]在耐辐射球菌的研究中发现耐辐射球菌在辐射前和辐射后有37种蛋白质的表达发生了改变，通过MALIDI- TOF-TOF鉴定发现这些蛋白质分别是Ssb、DdrA、RecA等，这些蛋白质具有DNA修复和抗氧化应激的作用。除此之外，Susanne R^[24]等研究者在对角质细胞用低剂量的砷和电离辐射进行处理，4天后发现角质细胞有7种蛋白质的表达发生了改变，经MALIDI-TOF-TOF鉴定得出这些蛋白质分别是烯醇化酶、热休克蛋白、乳酸脱氢酶、蛋白二硫化物异构酶前体等，热休克蛋白在以往的研究中就发现其参与了低剂量辐射诱导的适应性反应。

目前，对蛋白质组研究的技术有很多，常用的主要有双向凝胶电泳和质谱技术等。与它们相比，生物信息学在蛋白质组学的研究中也起着特殊的重要作用^[25]。这些研究为揭示蛋白质在低剂量辐射诱导的适应性反应中发挥的功能起重要作用。

2.2 蛋白组学技术在其他辐射效应研究中的应用

关于辐射其他的生物学效应学者们也做了很多的相关研究。研究者Pluder^[26]把人血管内皮细胞系EA. hy 926分为实验组和对照组，实验组接受100 mGy低剂量的γ射线照射，利用2D-DIGE来发现实验组和对照组蛋白质表达的改变，结果发现Run和RhoA途径、脂肪酸代谢和应激反应等途径的蛋白质水平都受到了辐射的影响。人内皮细胞系EA. hy 926被高剂量辐射诱导成血管损伤模型，然后研究血管内皮细胞损伤后蛋白质表达的改变，Sriharshan^[27]让EA. hy926接受2.5 Gy的γ射线照射4 h和24 h，利用SILAC和2D-DIGE来研究EA. hy 926被2.5 Gy的γ射线照射后蛋白质的改变，参与这些生物过程，如醣酵解、氧化磷酸化、Rho介导的细胞运输、非同源性末端连接等的蛋白质表达发生了显著的变化，其中4h照射组与未照射组相比，涉及代谢活动、应激反应和细胞凋亡的蛋白质表达量增高; 24h照射组与未照射组相比细胞信号、转录活性相关蛋白有下降趋势。Yentrapalli等^[28]研究者第一次用蛋白组学的方法来探索由慢性低剂量γ射线照射诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)产生的细胞早熟性衰老现象，通过蛋白质组学数据分析可以得出慢性辐射引起的DNA损伤和氧化应激，可以激活p53/p21途径，抑制血管内皮细胞增殖，引起了细胞的过早衰老。为了研究辐射能够引起不同组织器官出现特异的蛋白标记物，Lim等^[29]将小鼠接受1 Gy的射线照射，然后用2-DE来检测小鼠组织，包括脑、肺、脾和肠在照射后蛋白表达的改变。通过比较蛋白质组学、免疫印迹分析显示葡萄糖醛酸转移酶1和磷酸甘油酸激酶1这两个蛋白质成为大脑、肠的特异性蛋白标记物。Azimzadeh等^[30]用3 Gy的射线对小鼠进行全身照射，然后利用互补的定量蛋白质组学方法ICAT和2D-DIGE检测心脏蛋白质组表达的改变，结果发现辐射能立即引起小鼠心脏细胞生物反应变化，包括炎症、抗氧化防御结构蛋白和重组结构蛋白表达的改变。这项研究发现辐射能引起应激蛋白功能障碍，除此之外还发现线粒体蛋白是对辐射最敏感的蛋白质。Beli等^[31]研究者将细胞接受10Gy的高剂量射线照射，利用SILAC方法，并结合蛋白质富集技术，分析蛋白质的磷酸化和乙酰化是否参与了DNA损伤效应。研究证实了以前的假设，DNA损伤反应的调节主要发生在转录后水平调控，除此之外还发现蛋白质的乙酰化发生速度要比蛋白质磷酸化慢得多。

3 蛋白组学在低剂量辐射诱导的适应性反应研究中的应用前景

蛋白质组学技术是研究辐射效应机制的重要手段，双向电泳、MS、ICAT、SILAC、iTRAQ、生物信息学等先进技术和信息资源在研究辐射生物学效应中都是不可或缺的。这些技术和信息资源为辐射研究提供了强有力的工具。虽然蛋白质组学技术发展迅速，但仍有一些问题有待于解决，因为一些细胞和组织经过高剂量辐射后蛋白质变化仍然很微妙，目前的蛋白质组学技术并不能很好地解决这个问题，蛋白质翻译后修饰就是问题之一。Beli等^[31]在辐射研究中发现细胞接受10Gy的高剂量辐射后只有1%的蛋白质磷酸化上调二倍多、约3.5%的蛋白质磷酸化上调1.5倍。在不同的蛋白组学研究中发现当蛋白质差异表达低于1.5倍时是没有生物学意义的^[32-33]。随着蛋白质组学技术的迅速发展，预计在未来的几年，即便是很小的辐射生物学效应，分析细胞蛋白质组的差异在经济上和技术上都是可行的。STORE数据库整合放射生物学所有数据，为熟悉由辐射效应引起的蛋白质的网络连接、基因及调节因子之间的相互作用关系提供了良好的平台。总之，随着蛋白质组学技术的不断发展，将会给辐射研究带来新的发展和希望。