随着辐射分子生物学研究的不断深入, 越来越多的电离辐射研究转向DNA的损伤和修复。单细胞凝胶电泳(SCGE), 又称彗星试验(comet assay), 能从单细胞水平检测DNA双链断裂(double strand break, DSB), DHEA (17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯)是一种新型的雌激素衍生物, 我们在前期实验结果表明, DHEA对辐射暴露小鼠造血系统具有保护作用[1], 联合γ射线对荷瘤小鼠有协同抑瘤作用[2], 为进一步证实DHEA对辐射的防护作用, 本实验选用DHEA与同类雌激素类抗放药, 通过动物实验研究它们对放射损伤的防治效果, 为其用于放射损伤的防治提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 动物IRM-2近交系小鼠60只(由我所培育), 雄性, 体重20~22 g, 合格证号:SCXK (津)2005 -0001, 饲料为清洁级全价鼠料, 由北京科奥协力饲料有限公司提供。
1.2 主要仪器与试剂水平电泳仪为美国BIO-RAD公司产品, RPMI1640培养液购自美国Invitrogen Corporation, 137Cs γ射线照射源由加拿大原子能有限公司提供。DHEA (17a α-D-高炔雌二醇-3-乙酯)是本所合成的雌激素类辐射防护剂, 白色粉末, 无味。炔雌醇(EE2)由四川省放射卫生防护所供给, 尼尔雌醇(523)由军科院供给。正常熔点琼脂糖凝胶购自Biowest公司, 低熔点琼脂糖凝胶为美国Promega公司产品, Tris-HCl、二甲亚砜(DMSO)和Triton X-100均为美国Sigma公司产品。
1.3 分组及给药将小鼠分为对照组、炔雌醇(EE2)组、尼尔雌醇(523)组和DHEA组, DHEA组分为5 mg/kg、7.5 mg/kg、10 mg/kg (低、中、高剂量组), 每组各10只, DHEA与EE2(25 μg/0.2 ml)分别在照射前3 d、2 d、1 d连续3次腹腔注射给药, 0.2 ml/只, 在照射前7 d、3 d分2次给予523(5 mg/kg), 0.2ml/只。给药后24 h进行2.0 Gy全身照射(剂量率0.87 Gy/min)。1~2 h之间采用单细胞凝胶电泳(SCGE), 检测照射后的小鼠淋巴细胞DNA双链断裂, 并观察彗星尾部DNA%(tail DNA%, TDNA%)、彗星尾长(tail length, TL)、Olive尾矩(olive tail moment, 0IM)和彗星尾矩(tail moment, IM)。
1.4 淋巴细胞分离实验取外周血0.2 ml, 肝素抗凝, 加入0.2 ml淋巴细胞, 3500 r/min离心4 min。取淋巴细胞后加PBS, 使之总量至2 ml, 再1500 r/min离心6 min后, 重复洗涤细胞两次。用PBS调整细胞浓度为2 × 104/ml置于4℃冰箱备用。
1.5 单细胞凝胶电泳实验采用Banath等[3]的SCGE方法, 用淋巴细胞悬液配置75%低熔点琼脂糖凝胶, 铺于第1层凝胶上面, 放在4℃冰箱内固化, 用中性裂解液在4℃冰箱中裂解1.5 h, 双蒸水漂洗, 静置20 min (在4℃电泳液中)后, 电泳20 min, EB染色, 荧光显微镜观察彗星, 每组摄100个彗星图像进行分析。
1.6 图像分析彗星图像采用波兰弗罗茨瓦夫大学提供的CASP[4]系统自动分析。
1.7 数据统计统计结果用x ± s表示, 两组比较用t检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各实验组小鼠2 Gy γ射线辐照后淋巴细胞DNA双链断裂的各项指标结果见表 1, DHEA三个剂量组、EE组、523组各项指标TDNA%、TL、TM和OTM残余损伤比对照组减少, 与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01), DHEA中剂量组的TDNA、TL、TM和OTM与EE2组和523组比较差异有统计学意义(P < 0.01), DHEA高剂量组的TDNA与EE2组和523组比较差异有统计学意义(P < 0.01), DHEA高剂量组的TL与EE2组和523组比较差异有统计学意义(P < 0.01、P < 0.05), DHEA低剂量组的TM与EE2组和523组比较差异有统计学意义(P < 0.01), DHEA高剂量组的TM与EE2组和523组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。
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表 1 2 Gy γ射线辐照后小鼠淋巴细胞DNA双链断裂的各项指标(x ± s, n=10) |
由图 1彗星图像可见, 各组受照射小鼠淋巴细胞均出现拖尾现象, 对照组DNA片段的迁移长度明显增加, 彗星尾长明显大于各给药组的彗星尾长, 而DHEA各组彗星尾长明显降低。DHEA中剂量组的彗星尾长最低。
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图 1 各实验组2Gy照射后各组彗星图像 |
SCGE是20世纪80年代建立的用于检测DNA断裂的新技术[5], 在国内肿瘤学、生物学、毒理学等基础研究中应用较为广泛, 绝大多数SCGE研究均是通过在显微镜下目测彗星长度或尾长分析剂量效应关系, 其不足之处是在较大剂量时曲线平台的出现[6], 而尾矩和Olive尾矩等矩类指标更具有灵敏性和准确性[7]。我们的实验结果看出, 各组小鼠经2.0 Gy照射后, 各组细胞的DNA损伤有所差异, DHEA低、中、高剂量组的TDNA%、TL、TM和OTM残余损伤指标明显低于对照组、低于EE2组和523组。该结果与前期小鼠经1.0 Gy辐照后的DNA损伤实验结果的趋势相同[8], 但各组的细胞的DNA残余损伤的各项指标的数值均明显升高, 显示出了明显的剂量效应关系, 随着照射剂量加大, 细胞的DNA残余损伤数值越大。此实验结果再次验证了DHEA中剂量组的TDNA%、TL、TM和OTM残余损伤程度最轻, 对DNA损伤修复作用最好, 说明DHEA预防用药具有保护和减轻辐射对淋巴细胞损伤的作用。
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