随着医用辐射诊疗、核能事业以及航天航空事业的发展以及同位素在工农业中的应用, 国民各部门应用和接触辐射的人员与日俱增。在辐射事故中需要确定受照射剂量以便能够做好急、慢性辐射损伤伤员的分类、诊断和治疗工作目前剂量估算方法主要有三大类:物理方法、生物方法和临床指标。目前国际上生物剂量计指标存在许多种, 包括染色体畸变、微核率、DNA损伤分析、基因微阵列分析以及蛋白标志物分析等方法。本文就在辐射事故中常用的及新出现的生物剂量计作一综述。

1 染色体畸变分析

目前, 染色体畸变还是作为辐射生物损伤效应和生物剂量估算分析普遍采用的检测手段^[1]。电离辐射可诱导染色体发生非稳定性畸变和稳定性畸变, 双着丝粒是目前最常用的生物剂量评估指标, 自发频率低, 对射线有特异性, 容易辨认, 能够对局部照射进行估算^[2], 但属于不稳定性畸变, 畸变细胞数量随分裂周期的循环而减少, 丢失的速度取决于淋巴细胞更新的速率, 大概需0.5~3 a便可回归到正常水平, 在大剂量和高LET射线急性照射后丢失更为明显^[3]。在有丝分裂过程中产生的易位和倒置属于稳定性畸变, 不随细胞的分裂和时间的延长而减少, 因此可以用此做剂量回顾, 甚至能估算出几年、几十年前的受照剂量^[4]。但是, 传统的染色体成带或组分技术操作费时, 分析技术和技术要求高, 不适合推广应用。近些年出现的FISH技术来分析稳定性畸变很有效果且大大提高了染色体畸变分析在指示生物剂量应用中的敏感性、适应剂量范围和精确度^[5]。

2 PCC分析

1970年, Johnson首先提出了早熟染色体凝集技术, 学者们对早熟凝集染色体-环进行剂量估算做了大量研究, 发现早熟凝集染色体环与受照剂量呈依赖性^[6]。早熟染色体凝集技术可诱导静止期细胞的分裂, 且估算剂量可达20 Gy, 扩大了估算对象。但该方法制备费时, 技术要求高, 产额低, 不稳定, 所以用来估算受照剂量可靠性较差^[7]。后来研究者将PCC与FISH技术结合起来应用, 可以解决计数细胞数量不足以及标本不容易辨别等难题, 且估算出的剂量与物理方法得到的基本相同^[8-9]。FISH技术也有不足, 容易受到其他因素的影响^[10]。

3 微核分析

微核作为染色体畸变的补助手段在生物剂量估算领域已得到了广泛的应用, 尤其在低剂量范围内或者需分析细胞数较多情况下, 微核检测显得更加方便, 已经证明微核发生率与射线剂量呈正相关^[11]。淋巴细胞微核在分析速度和对人员技能要求上具有明显的优势, 特别适用于大量人群受低剂量照射的分析, 能较快的提供估算剂量^[12]。缺点是估算范围适合4 Gy内, 而且容易受到吸烟、化学品、年龄及性别等因素的影响, 个体差异较大^[13]。近些年研究者发现辐射诱导的微核可能来自染色体断片较少含中心粒, 而大量自发的微核含有中心粒。利用中心粒特异的FISH探针技术可将辐射诱导产生的与自发的的微核区分开来, 从而增加了微核分析数据的准确性。

4 DNA损伤分析 4.1 细胞凝胶电泳或彗星电泳分析

该技术可在单细胞水平上对DNA损伤进行定性定量测定。该方法先将制备好的细胞悬液铺在有凝胶的载玻片上, 置载玻片于电泳槽电泳。碱性突变位点、不完全的DNA、断裂的DNA链以较快速度迁移, 形成彗尾。而DNA与DNA交联或DNA与蛋白交联的片段迁移较慢, 形成慧核。将得到的图像用专门的计算机软件对其分析, 来评价DNA的损伤, 建立量效关系。此方法的优点是细胞用量少, 灵敏度高, 快速、简单、经济^[14]。缺点是该方法敏感性太高, 判断DNA损伤类型的特异性较差。此外, 在DNA损伤的同时伴随着重接修复, 故分析DNA链断裂要求照射后立即采样进行分析, 否则分析离照后时间越长, 误差越大。

4.2 DNA损伤荧光免疫测定

免疫荧光测定方法是利用荧光标记的抗单链断裂和碱基损伤的抗体与断裂部位或受损碱基的特异结合, 通过测定荧光强度确定DNA链断裂或碱基损伤的量, 来确定照射剂量, 可测出的照射剂量范围是10 Gy以内。由于DNA单链断裂和碱基损伤会迅速修复, 因此该方法只适合在照后4小时内进行。

5 基因微阵列分析

基因芯片具有高信息集成、高通量分析的优点, 为生物剂量计的研究提供了广阔的平台。Jen等利用微阵列分析淋巴母细胞受到γ射线3 Gy和10 Gy照射后, 24小时后分别得到319条和816条反应基因, 其中共有基因是126条, 因此不同的照射条件会产生不同的反应基因谱^[15]。但是环境、生理、病理和精神等会影响基因表达的改变, 这些改变可能与电离辐射诱导的基因改变相互叠加, 因而建立一套用作标识辐射剂量的基因谱非常困难, 该项技术的复杂性使得其在电离辐射生物剂量的研究中裹足不前^[16]。

6 蛋白质生物标记物分析 6.1 GPA

GPA是存在于红细胞表面的一种血型糖蛋白, 早期多数报道认为GPA突变率与照射剂量存在良好的量效关系。有学者对切尔诺幸存者的GPA基因座突变频率进行研究, 发现其剂量-效应关系基本上符合线性模型^[17], 与染色体畸变分析比较, 二者可以相互验证。该方法的优点是灵敏、快速、采样方便、稳定性好^[18-19]。后来研究者们发现许多因素(如年龄、吸烟)能够引起GPA突变, 若排除影响, 受照人群与未受照人群GPA突变的差异并没有统计学意义^[20]。此外, GPA估算受照剂量也只适合MN杂合子人群的分析, 约占人群的50%, 不适合低剂量慢性照射进行剂量评估^[21]。

6.2 HPRT

HPRT是一种合成补救通路的磷酸核糖转移酶, 失去HRPT活性的突变细胞可在含6-巯基嘌呤培养环境中存活, 随照射剂量增加, HPRT基因突变频率也增加, 理论上根据培养基中克隆生长率便可估计受照剂量。研究表明, 该基因突变率与照射剂量具有良好的线性关系。此方法简便、快速、灵敏, 很有成为分子生物剂量计的潜力^[22]。但该方法细胞克隆生长时间较长, 尤其在大剂量照射后低克隆率, 此外HRPT自然突变率的变异较大^[23], 这些不利因素限制其应用。

6.3 异型组蛋白H2AX的磷酸化形式(γ-H2AX)

现在, γ- H2AX已经成为一种成熟的辐射诱导的DNA双链断裂的生物标志物, 通过免疫荧光显微镜对γ-H2AX焦点进行计数便可灵敏的检测到未被修复的DNA双链断裂损伤程度, 因此γ- H2AX在电离辐射剂量估算中具有潜在应用价值^[24]。该方法已经应用在大量确定放化疗、心脏介入手术^[25]及诊断CT扫描^[26]病人的DNA损伤的研究中。机体受到照射后细胞核内γ -H2AX焦点数即刻增多, 1小时达到高峰, 随时间延长, 焦点数迅速减少, 几天内便可基本消失, 结果显示在2 Gy范围以内γ-H2AX焦点数与辐射剂量呈正向依赖关系, 并可以区分局部照射和均匀照射^[27]。不足的是随着DNA的快速修复, γ- H2AX焦点快速消失, 在观察时间上很难把握, 也存在个体差异, 诸多因素降低了该指标作为生物剂量计的灵敏度。

研究者们正在进一步优化γ-H2AX的测定法, 尝试通过测定血液中γ-H2AX浓度来估算辐射剂量^[28]。总之, γ- H2AX测量法能确保大样本的快速检测和受照剂量的快速准确的评估, 对近期可能受到急性照射的人员进行快速筛选, 为实现快速和高通量的要求, 新型的快速的分子生物学方法γ- H2AX分析技术很有潜力成为应急检测的手段。

6.4 C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)

CRP是由肝脏合成的一种敏感的急性时相反应蛋白, 是一种应激反应的生物标志物, 其具有抗感染、抗损伤等功能。研究报道, 灵长类在受到6.5 Gy的全身的X或γ射线照射8~24h后, 血清中CRP含量迅速升高, 且CRP与剂量呈正相关性, 但不能区分局部和均匀照射, 也不能用来估算内照射^[29]。CRP不能在体外诱导生成, 关于CRP建立剂量-效应-时间曲线的体内的研究也甚少, 关于射线品质引起CRP的变化还没有定论。因此CRP不适合作为一个特异性生物剂量指标, 但可作为一个多参数生物剂量系统的一个组成部分, 也可以在大规模辐射事故提供快速的最初的筛选鉴别, 特别是对复合伤^[30]。

6.5 血清淀粉酶(Serum amylase, SA)

研究表明SA水平呈剂量依赖性, 照后开始上升, 18~30 h后便达到高峰期^[31]。SA的测定方法简便易行、费用低廉, 反映病情变化、判定预后的一个重要指标。血清中的淀粉酶主要来自胰腺和唾液腺, 所以这两个腺体受到照射时才能用其来估算受照剂量, 即不能用来估算局部照射剂量^[31]。此外, SA水平存在个体差异, 一些因素(包括情感、压力)也影响了淀粉酶作为独立的的辐射生物剂量计^[30]。γ-H2AX、CRP及SA在受照后与电离辐射呈剂量依赖性, 但随着DNA的快速修复, 这些蛋白标志物在照后很短的时间内就开始消失, 甚至几天后便可达到正常水平。因此, 这些指标作为生物剂量计还是很敏感的, 但仅可用来估算近期受照估算, 不能用来回顾性分析。

7 展望

未来的研究目标是优化双着丝粒分析方法和实现高通量, 主要包括实现细胞自动化培养^[32], 研发配有评价软件的显微镜以及实现实验室的联网合作^[33]等。这些目标实现将会完善放射工作人员的生物剂量监测系统, 也能在核事故早期提供更准确的受照剂量。利用FISH技术能够快速捕获畸变图像, 使得自动化染色体分析更成为一种可能。

由于基因技术更易实现全自动化, 所以比其他生物剂量计的发展更具有潜力, 目前主要集中在对使用微阵列和定量聚合酶链反应技术的发展, 基因技术目前不能准确的估算受照剂量, 但可快速的鉴别出超过阈值的受照人员。

电离辐射可诱导体细胞部分编码标志蛋白的基因位点突变, 从而产生蛋白异常或缺失, 这些异常或缺失的蛋白可作为剂量监测的标识。分析蛋白质生物标志物(γ-H2AX、CRP、SA)用到细胞化学技术较传统的细胞遗传学具有优势, 例如传统的细胞遗传学分析法需要数天, 细胞化学技术可在数小时内获得结果, 并可实现自动化和高通量。蛋白标记物可以从唾液, 口腔上皮细胞, 毛发中获得, 实现无创。蛋白标志物作为生物标记物存在缺点, 缺乏辐射特异性, 并且随时间而迅速减少, 因此蛋白标志物作为剂量计可能更有前景, 但作为特异性生物剂量计的路仍很长。目前, 研究者们用CRP和SA来估算放疗患者受照剂量, 得到的数据和照射剂量基本吻合, 但用该指标来估算"正常人"的受照剂量还需要进一步研究。这些蛋白质标记可能不适合作为单独的生物剂量计, 但可以组成一个多参数生物剂量系统, 该系统的标记物都与剂量呈依赖性的^[30]。

综上所述, 限于每种标志物都有局限性, 研究者们正在努力改进旧的方法, 寻找新的方法。一个理想的(生物)剂量计的要求:具有特异性、不同剂量估算范围、遗传背景稳定、能够估算局部受照剂量、区别内部和外部照射、良好的量效关系、适应不同辐射品质和剂量率、能够建立一条体外校准曲线、个体变异小、影响因素明确且可控制、无或微创取样、标准化, 快速(自动)和廉价样品的处理和分析等特点。鉴于此, 未来的剂量计可能将所有的标志物结合起来, 向一个集成的剂量测定系统方向发展。该检测评分系统可以作为的大规模辐射事故的一个可依赖的检测工具, 能确保大样本的快速检测和受照剂量的快速准确的评估, 对可能受照的人体进行快速的鉴别分类, 并能进行各实验室的联网合作^[34-35]。